质粒的转化1实验样品.ppt

实验:大肠杆菌感受态细胞制备及转化 实验目的 掌握制备和保存大肠杆菌感受态细胞的方法 掌握转化的方法技术 了解转化过程中各因素对转化率的影响 实验背景简介 重组蛋白为什么表达量不高或不表达？ 重组蛋白在大肠杆菌中表达的分子量为什么偏小？ 有些大肠杆菌表达重组蛋白为什么没有活性？总是形成包涵体？ 基因表达体系 1.? 原核体系 2. 真核体系 常用表达载体 大肠杆菌 (Escherichia coli) 遗传背景清楚，基因工程操作方便，商品化表达载体种类齐全，表达效率高； 基本不分泌，易形成包含体(无正确折叠的立体结构)，无加糖等修饰 枯草杆菌 (Bacillus subtilis) 分泌蛋白质能力强，一般有天然立体结构； 无加糖修饰功能，培养液中蛋白酶活性高，重组蛋白易受蛋白酶的水解； 质粒不稳定 大肠杆菌常用克隆菌株 JM109 HB101 DH5a XLblue TG1 C600 外切酶和内切酶活性缺陷（recB-，recC-，hsdR-） 及重组整合缺陷型（recA-） 特殊的表达用菌株 体系选择 研究基因功能: 大肠杆菌, 裂殖酵母,昆虫细胞, CHO细胞 多肽药物生产: 大肠杆菌, 毕氏酵母, CHO细胞, 乳腺组织 疫苗: 大肠杆菌, 酵母, 单抗生产: 杂交瘤细胞 工业酶生产: 各种微生物 受体菌与质粒的选择 受体菌： E.Coli DH5α：无Ap抗性 外源质粒 Ampr抗性基因编码一种周质酶（β-内酰胺酶）可特异地切割Amp的β-内酰胺环，从而使其失去杀菌能力 选择: 如进行蓝白斑筛选时可选用DH5α 、JM109 、 TG1 ； 用T7启动子进行原核表达时可选用BL21(DE3)； 0 细菌产生感受态的类型 自然转化（natural transformation） 在生长周期的任何时刻自动产生感受态；（e.g. 枯草杆菌） 工程转化（engineered transformation） 在生长周期的特定时刻产生感受态；（e.g .大肠杆菌） 1、局部原生质体化假说——细胞表面的细胞壁结构发生变化，即局部失去细胞壁或局部溶解细胞壁，使DNA 分子能通过质膜进细胞。 2、酶受体假说——感受态细胞的表面形成一种能接受DNA 的酶 位点，使DNA分子能进入细胞。 Ca2+诱导DNA对大肠杆菌细胞的转化： ①在0℃的Cacl2低渗溶液中，细菌细胞发生膨胀，同时Cacl2使细胞膜磷脂层形成液晶结构，促使细胞外膜与内膜间隙中的部分核酸酶解离开来，诱导大肠杆菌形成感受态。 ②Ca2+能与加入的DNA分子结合，形成抗DNA酶(DNase)的羟基-磷酸钙复合物，并黏附在细菌细胞膜的外表面上。当42℃热刺激短暂处理细菌细胞时，细胞膜的液晶结构发生剧烈扰动，并随之出现许多间隙，为DNA分子提供了进入细胞的通道。 该法重复性好。操作简便快捷，适用于成批制备感受态细胞。对这种感受态细胞进行转化，每μg质粒DNA可以获得5×106～2×l07个转化茵落，完全可以满足质粒的常规克隆的需要。 可能的转化机制 ＤＮＡ分子转化过程分以下几步: １．吸附——双链ＤＮＡ分子吸附于受体菌表面； ２．转入——双链ＤＮＡ分子解链。一条链进入受体菌，另一条降解； ３． 自稳——外源质粒ＤＮＡ分子在细胞内复制成双链； ４．表达——供体基因随同复制子同时复制，分裂， 转录翻译。 重组子的筛选 这和受体菌：质粒ＤＮＡ的选择相关， 原则上要注意： １．受体菌必须是限制与修饰系统缺陷的菌株； ２． 根据质粒基因型和受体菌基因型互补原则而定。 重组子的筛选方法常用的有两种方法： 抗生素筛选法 互补法 抗生素筛选法 菌株为某种抗生缺陷型， 而质粒上带有该抗性基因（如氨苄青霉素等）这样只有转化子才能在含该抗生素的培养基上长出。 本实验利用抗生筛选转化子。 互补法 许多载体都具有一段大肠杆菌β半乳糖苷酶的启动子及其α肽链的DNA序列，此结构称为lac Z′基因。Lac Z′基因编码的α肽链是β半乳糖苷酶的氨基端的短片段（146个氨基酸）。宿主细菌带有β-半乳糖苷酶C 端部分序列。宿主细菌和质粒编码的片段各自都不具有酶活性，但它们可以通过片段互补的机制形成具有功能活性的β半乳糖苷酶分子。 Lac Z′基因编码的α肽链与失去了正常氨基端的β半乳糖苷酶突变体互补，这种现象称为α互补。 Α-互补 细菌的生长状态：大肠杆菌在对数中期易产生感受态 OD值：0.3－0.5 (5X107个/ml) 试剂的质量：