用户手册 - icloning.pdf

Ni-NTA Agarose 用户手册 克劳宁（北京）生物科技有限公司 北京市海淀区中关村西区天创科技大厦407A 邮编:100080 电话: 0086-10 传真: 0086-10 电邮: mclab@ 订购: order@ 咨询: info@ 网站: 目录 用户手册介绍 1 细胞裂解 1 昆虫细胞裂解 1 哺乳动物细胞裂解 1 蛋白纯化-非变性条件 2 蛋白纯化-变性条件 2 蛋白纯化-混合条件 3 Ni-NTA树脂活化 3 组成成分 3 疑难解答 4 2011年12月修订 Ni-NTA 纯化 起 MCLAB Ni-NTA agarose beads可用于从细菌、昆虫及哺乳 - 室温条件下，轻轻混匀菌体细胞，作用5~10分钟 动物细胞中纯化高质量的6x HIS-tagged 重组蛋白。由于Ni- - 用微型探头超声菌体，5秒每次，高强度超声3次 NTA agarose beads对6x his-tagged residue的选择性和高 - 3000 x g离心15分钟，以沉淀裂解液中的细胞碎片，将上 亲和性，使其可广泛用于蛋白纯化。 清转移至另一个新的容器内。 可对感兴趣的蛋白在变性、非变性或混合条件下进行纯化。 - 取5µl 用于SDS分析，其他的上清液置冰上或-20℃ 可在低pH条件下或使用竞争性结合分子比如咪唑洗脱Ni- 保存备用。 NTA resin结合的蛋白。 注意：含Guanidinium Lysis Buffer的样品在进行SDS 非变性条件和变性条件： 电泳前，需经过稀释、透析或TCA沉淀，以防造成SDS沉 如果你的目的蛋白在裂解上清液中可溶，且保持蛋白的活性 淀。 对于后续试验很重要，需要使用非变性纯化。 相反，如果你的目的蛋白在裂解上清液中不可溶，且蛋白活 昆虫裂解 性不重要，就可以使用变性纯化。 以下方案是针对杆状病毒感染细胞系，但该方案是通用的， 而如果你的目的蛋白在裂解上清液中不可溶，但保持蛋白的 用户可根据特定的细胞系进行优化。 活性很重要，就需要使用混合裂解条件，即蛋白的裂解及过 大规模蛋白表达应该在已知的蛋白最大表达时间点进行。一 柱在变性条件下完成，在蛋白复性阶段用非变性缓冲液进行 般来说，蛋白表达在接种细胞的1升烧瓶中进行，细胞密度为 洗涤和洗脱。请注意，这只是一个大概的试验方案，并不适 2×106个细胞/ ml，总体积为500ml。当MOI为10 pfu/细胞 用于所有的蛋白。 时，细胞感染病毒的滴度最高。在蛋白最高表达点，用50ml 管离心收获细胞，并储存在-70℃备用。 细胞裂解 昆虫细胞裂解-非变性条件 材料 - 制备8ml 含0.5µg/ml Leupeptin的Native Binding Buffer 缓冲液的组份参见第3页 - 将50ml培养物5000rpm离心5分钟，收获菌体细胞，加入 - 非变性裂解液binding buffer 8ml 含0.5µg/ml Leupeptin的Native Binding Buffer重新悬 - 超声波仪 起细胞。 - 10 µg/ml RNase 和 5 µg/ml Dnase I