cytomicsnewsletter 2006-17 细胞分析术半月快讯 细胞分析术半月 .docVIP

细胞分析术半月快讯 第17期 1…….流式细胞仪嗜碱性粒细胞及其活化检测 2…….细胞分析术最新文献及动态摘要 欢迎浏览我们的网站： 流式细胞仪嗜碱性粒细胞及其活化检测 BD快速免疫检测试剂组合CD63FITC/CD123PE/Anti-HLA-DRPerCP 嗜碱性粒细胞形态学描述 嗜碱性粒细胞（basophil,B）胞体呈圆形，直径10-12um。胞质紫红色内有少量粗大但大小不均，排列不规则的黑蓝色嗜碱性粒细胞，常覆盖于核面上。胞核一般为2-3叶，因被颗粒遮盖，核着色较浅，而使分叶有模糊不清感。 嗜碱性粒细胞参考值 1％；绝对值为（1-0.1）*109/L 嗜碱性细胞临床意义 嗜碱性粒细胞增多见于：（1）过敏性疾病：过敏性结肠炎，药物，食物吸入物超敏反应，红斑及类风湿关节炎等（2）血液病：慢性粒细胞白血病，嗜碱性粒细胞白血病，以及骨髓纤维化等（3）恶性肿瘤：特别是转移癌时嗜碱性粒细胞增多。（4）其他如糖尿病，传染病如水痘，流感，天花，结核等，均可见嗜碱性粒细胞增多。嗜碱性粒细胞减少无临床意义。 特异性描述 CD63抗原为53-kilodaltonkd），Ⅲ型溶酶体膜蛋白 ,包括单核细胞细胞 Pltgp40, LAMP-3,且同属四跨膜超家族主要组织相容性复合体P3x653 Ag8骨髓瘤细胞。 CD123抗体，克隆号9F5，来源于经IL-3Ra转染COS细胞免疫的融合了BALB/c小鼠脾细胞的NS-1细胞。 HLA-DR抗体，克隆号L243，来源于经人B淋巴细胞系RPMI8866免疫的小鼠NS-1/1-Ag4骨髓瘤细胞。 组成 CD63和CD123抗体各由小鼠IgG1重链和kappa轻链构成。抗HLA-DR抗体由小鼠IgG2a重链和kappa轻链构成。BD快速免疫组合CD63/CD123/Anti–HLA-DR试剂提供作为CD63FITC,CD123PE,和抗HLA-DR Percp的组合，保存在1.0mL的含小牛血清（BSA）和0.1%叠氮钠磷酸缓冲盐（PBS）溶液中。 研究应用： 全血中嗜碱性细胞 嗜碱性细胞活化 外周血和淋巴组织中树突状细胞 直接免疫荧光法 产品 BD快速免疫CD63 FITC/CD123 PE/Anti–HLA-DR PerCP 货号：341068 20ul/test 直接免疫荧光法方法 活化： 1·在12 x 75-mm管中各加入含或不含有过敏原的嗜碱细胞抗原刺激液（BSB）20ul，置入管底。 ·阴性刺激物对照——仅有BSB（没有过敏源） ·阳性刺激物对照——用fMLP (N-Formyl-Met-Leu-Phe)稀释2-uMBSB浓缩液 ·检测样本——在BSB中加入花粉或其他过敏原 2·加100ul全血（肝素抗凝）到所有刺激物管中，轻轻振荡混匀，并在37°C水浴中孵育10－15分钟。 3·孵育完成后立即将样本管转移到冰浴或者加10ul20-mMEDTA室温孵育5分钟来停止脱粒。 染色： 1·在每一管中加入20ulCD63 FITC/CD123 PE/Anti–HLA-DR PerCP抗体，振荡混匀，避光冰孵20分钟或室温避光孵育15分钟（用EDTA抗凝）。 2·在每个样本中加入2mlBD FACS?溶血剂，室温避光放置15分钟。 3·300 xg离心5分钟，去上清。加1－2mlPBS再洗涤一遍。 4·加0.3ml含0.5%福尔马林溶液（PFA）重悬细胞。上机检测。 典型数据分析 进行全血溶血操作。在具有488－nm激光器的BD FACS?流式细胞仪上分析样本。开始获取数据，阈值设在FL2通道上，在FL2上去除多数CD123-阴性细胞，至少采集500 CD123-阳性细胞。通过低SSC信号，CD123-阳性，HLA-DR－阴性来鉴别嗜碱性细胞（如图1）。通过CD63FITC(FL1)来定量检测活化或脱颗粒的嗜碱性细胞。通过阴性对照设定阳性界线，并建立FL1vsFL2点图进行观察（Figure2）。 图-1嗜碱性细胞鉴别设门策略 图-2为对花粉的过敏和不过敏性病人检测的典型数据。样本与缓冲液、阳性刺激物、和花粉在37°C下孵育10分钟。通过R1和R2设门可以圈定嗜碱性细胞（见图1） 图-2为典型的FL1直方图和FL1vsFL2点图 处理和储存 试剂2-8°C储存。荧光标记的抗体不可被冷冻或长时间置于光源下。如按指导保存抗体，抗体可在瓶子标签上所示保质期内保持稳定。 参考文献 1. Azorsa DO, Hyman JA, Hildreth JEK. CD63/Pltgp40: a platelet activation antigen identical to the stage-specific,