肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋白转化及表达研究 - yzxzcom.pdfVIP

维普资讯 第45卷 增刊 厦 门大学学报 (自然科 学版) Vo1．45 Sup 2006年5月 JournalofXiamenUniversity(NaturalScience) M ay 2006 肠毒性大肠杆菌的绿色荧光蛋 白转化及表达研究 朱红梅 ，周涵韬 ，张赛群 ，曹 宜 ，刘 波 (1．厦门大学生命科学学院，福建 厦门361005；2．福建省农业科学院生物技术中心，福建 福州 350003) 摘要 ：通过电击转化法，将带有g 标记基因的pGLO质粒成功转化到肠毒素型大肠杆菌K 、K 中，经过紫外检测及荧 光显微镜检测均发现转化菌株发出绿色的荧光 ，表明星加基因得到稳定、高效的表达．进一步通过 PCR分子鉴定、血清型 鉴定、微生物学特性分析均表明，转化菌株与原始菌株是一致的．该转化菌株将为研究肠毒性大肠杆菌的致病机理及益 生索的筛选提供有效的手段． 关键词 ：肠毒性大肠杆菌；绿色荧光蛋白；遗传转化 中图分类号：Q943．2 文献标识码：A 文章编号：0438-0479(2006)S-0043-04 肠毒素性大肠杆菌 (EnterotoxigenicEscherichia 蛋白胨为上海生工 BBI公司产品，酵母抽提物为 coli．，ETEC)是一类引起人和幼畜(初生仔猪、犊牛、 OXOID公司．dNTPs、TaqDNA 聚合 酶、购 自上海生 羔羊及断奶仔猪)腹泻的重要病原菌，初生幼畜被 工；100bpDNALadder购 自Biolabs． ETEC感染后，常因剧烈水样腹泻和迅速脱水而死亡， BECKMAN冷冻离心机，Bio—RadGenePulser1I 发病率和死亡率均很高，是 目前的研究热点之一…． 电穿孔仪，Bio—Rad电泳仪，OLYMPUS荧光显微镜． 猪源产肠毒素性大肠杆菌的黏附素抗原主要有 K蚋， 1．2 实验方法 K∞，987P． (1)质粒提取方法 来 自多管水母 (Aequoreavitoria)的绿色荧光蛋白 挑取紫外灯下发绿色荧光的质粒宿主菌DH5or (greenfluorescenceprotein，GFP)基因是 目前应用广 的单菌落，于 10mL含 100Ixg·mL-1Am p的LB液 泛的一种报告基因 J．在各种不同的系统中表达后， 体培养基 中，37℃振荡培养过夜．碱裂解法提取质 重组GFP均可吸收蓝光，发出明亮的绿色荧光．与其 粒 4【】．提取的质粒用0．8％琼脂糖电泳检测纯度． 它生物标记基因比较，它的最大优点是不需要任何底 (2)感受态细胞的制备 物或额外的辅助因子，利用其发出的荧光就可以实现 在NA液体中摇床震荡培养ETEC至 0D咖为 对生物的活体监测 】，为重组子的筛选及诸多生物学、 0．6，取菌液冰浴 10min，8000r／min4~C离心收集菌 免疫学试验提供了一个直观手段． 体．冰预冷的无菌水洗菌体4次，最后将菌体重悬于 本研究利用 基因标记ETEC，希望获得 基 10％甘油中，一70℃冰箱保存备用． 因稳定表达、特性稳定的发光标记菌株，’为进一步研究 (3)