微生物工程综合实验.docVIP

  1. 1、原创力文档(book118)网站文档一经付费(服务费),不意味着购买了该文档的版权,仅供个人/单位学习、研究之用,不得用于商业用途,未经授权,严禁复制、发行、汇编、翻译或者网络传播等,侵权必究。。
  2. 2、本站所有内容均由合作方或网友上传,本站不对文档的完整性、权威性及其观点立场正确性做任何保证或承诺!文档内容仅供研究参考,付费前请自行鉴别。如您付费,意味着您自己接受本站规则且自行承担风险,本站不退款、不进行额外附加服务;查看《如何避免下载的几个坑》。如果您已付费下载过本站文档,您可以点击 这里二次下载
  3. 3、如文档侵犯商业秘密、侵犯著作权、侵犯人身权等,请点击“版权申诉”(推荐),也可以打举报电话:400-050-0827(电话支持时间:9:00-18:30)。
  4. 4、该文档为VIP文档,如果想要下载,成为VIP会员后,下载免费。
  5. 5、成为VIP后,下载本文档将扣除1次下载权益。下载后,不支持退款、换文档。如有疑问请联系我们
  6. 6、成为VIP后,您将拥有八大权益,权益包括:VIP文档下载权益、阅读免打扰、文档格式转换、高级专利检索、专属身份标志、高级客服、多端互通、版权登记。
  7. 7、VIP文档为合作方或网友上传,每下载1次, 网站将根据用户上传文档的质量评分、类型等,对文档贡献者给予高额补贴、流量扶持。如果你也想贡献VIP文档。上传文档
查看更多
微生物工程综合实验

微生物工程综合实验 ——藻蓝蛋白的提取、纯化及紫外可见光谱仪检测藻蓝蛋白纯度 姓名:邱李莉 时间:2004-4-7——2004-4-28 实验目的 学习并掌握提取、纯化藻蓝蛋白及紫外可见光谱仪检测蛋白纯度的方法 实验材料 螺旋藻藻粉 实验设备 天平,量筒,塑料杯,药匙,小烧杯(5个),铁架台,铁夹,玻棒(若干),胶头滴管(若干),滤纸,收集器,树脂柱,梯度洗脱器,蠕动,磁力搅拌器,高速离心机 实验原理 1.冻融法:将细胞置低温下冰冻一定时间,然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。如此重复冻融多次,细胞可在形成冰粒和增高剩余胞液盐浓度的同时,发生溶胀破碎。 2.盐析法:蛋白质在稀盐溶液中,溶解度会随盐浓度的增高而上升(盐溶),但当盐浓度增高到一定数值时,其溶解度又逐渐下降,直至蛋白质析出(盐析)。盐析的发生在于盐浓度增高到一定数值时,使水活度降低,进而导致蛋白质分子表面电荷逐渐被中和,水化膜逐渐被破坏,最终引起蛋白质分子间相互聚集,并从溶液中析出。 3.DEAE-纤维素:英文名称DEAE-Cellulose,二乙基胺乙基纤维素,总交换量0.9meq/g功能基:二乙基胺乙基.弱碱性阴离子交换剂。 原理:含有某些功能基团,可以进行离子交换。性能比一般离子交换树脂温和,适用于分离具有生物活性的大分子,可以将性质相近的大分子物质分开。 4.葡萄聚糖凝胶:商品名称Sephadex,是效果较好的分子筛凝胶层析。 原理:分子筛指多孔介质。小分子能进入介质内部空隙,大分子物质排阻在介质之外,从而达到分离目的,这种作用为“分子筛效应”。 5.装柱:装柱前先将层析柱垂直固定在支架上。装柱的方法分干装和湿装两种。干装法是直接加吸附剂到柱中,然后倒入溶剂,此法不易将气泡排尽。湿装法是先加适量溶剂到柱中,排走其中的空气,然后把预先用溶剂浸泡好的吸附剂搅匀,随机将此悬浮液连续倾入柱中,打开柱下端出口,让溶液慢慢流出,使柱上端悬浮液缓缓下降至需要的高度,吸附剂表面要平整,应使其一直浸没在溶剂中,以防气泡产生。 6.加样:经过平衡的层析柱当平衡液流到与固定相表面一致位置时,用滴管轻轻地把分离样品的溶液加到固定相表面,要尽量避免冲动基质。加入样品液的体积一般应小于床体积的1/2(体积越小越有利于提高分辨率)。 7.洗脱:待样品液的液面流到固体相表面时,用滴管加入洗脱剂(5cm),并在柱上端与装有洗脱剂的储液瓶连接开始洗脱。同时在柱下端与部分收集器接通,立即进行分级收集(按体积或时间分管收集)。 洗脱流速:如果太快,洗脱物在两相中的平衡过程不完全,如果太慢,洗脱物会扩散。 8.测定:随后将收集的每管溶液进行浓度或活性测定。根据测定结果,即可绘制出洗脱曲线(以管号或洗脱体积为横坐标,以每管溶液样品的浓度或活性为纵坐标)。 实验步骤 取螺旋藻粉颗粒20粒,每颗0.5g,一共取藻粉0.5g/粒×20=10g ,倒入塑料瓶中,加提取液100ml。 将塑料瓶用滤纸封住瓶口置低温(-20℃)下冰冻一定时间,然后取出置室温下(或40℃左右)迅速融化。如此反复冻融多次(实验中此步骤我们只做了一次,其余由老师帮做),细胞可在形成冰粒和增高剩余胞盐浓度的同时,发生溶胀破碎。 实验现象: 解冻前:墨绿色固状(略带紫色) 解冻后:墨绿色溶液 冻融所得溶液分两次在10000rpm下高速离心15min,得到亮蓝色上清液67.8ml,用小烧杯收集,弃去下层墨绿色沉淀。 称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末8.72g,分多次缓慢加入小烧杯中,边加边搅拌,使溶液的(NH4)2SO4浓度达到20%。在10000rpm下高速离心15min,离心沉降后,取得亮蓝色上清液67.2ml,弃去蓝色沉淀。 称取之前已经研磨好的(NH4)2SO4固体粉末12.7g,分多次缓慢加入小烧杯中,边加边搅拌,使溶液的(NH4)2SO4浓度达到50%。在10000rpm下高速离心15min,离心沉降后,取得深蓝色沉淀,弃去黄绿色上清液。加不超过15ml 蒸馏水溶解所得沉淀备用(水因尽量少,有利于渗析)。 剪取约25cm长的层析袋,放入烧杯中煮沸5min(从水沸开始计时),将其中一头用细线扎住,对折后再用细线扎住。将之前溶解沉淀的溶液倒入层析袋中。放入蒸馏水中,4℃下透析2—3天。 取一支层析柱,检漏后清洗干净,用两个铁夹固定在铁架台上,要从正面和侧面检查是否竖直,如不竖直则作出调整。称取40g DEAE—纤维素—52于一烧杯,加150ml0.5MHCL溶液,轻搅,浸20min,小心倒掉上清液,补水到同一刻度,轻轻搅拌溶液,均匀地倒入柱中。柱中液面上要保留2~3cm的空间,之后液面每下移到原刻度位置,就补水到相应高度,使蒸馏水始终高于填料2cm以上。 以下由老师完成。用0.5MNaCL__0.5MNaOH溶液

文档评论(0)

wujianz + 关注
实名认证
文档贡献者

该用户很懒,什么也没介绍

1亿VIP精品文档

相关文档