农杆菌介导的方法.docVIP

实验九 植物遗传转化——农杆菌介导法 一、目的 了解农杆菌转化的机理；掌握农杆菌介导转化水稻的技术 二、原理 根癌农杆菌 (Agrobacterium tumefaciens)具有跨界转移DNA的能力。下列因子与转化过程有关： 1. Ti 质粒 (tumor-inducing plasmid)上的T-DNA (transferred DNA)  T-DNA是农杆菌Ti质粒上能够转移到植物基因组的一段DNA序列。T-DNA含有RB和 LB两个边界，它们是25bp的正向重复序列，是T-DNA 转移的顺式作用元件。不同类型的农杆菌其边界序列有所不同，但划线部分为完全保守序列。置于该边界内的任何外源基因均可被转化。LB缺失突变后农杆菌仍能致瘤，但RB缺失会导致致瘤能力丧失，这时几乎完全没有T-DNA的转移。 LB（－链）5’GTTTACACCACAATATATCCTGCCA 3’ RB（＋链）5’TGACAGGATATATTGGCGGGTAAAC 3’ 2. Ti质粒上的Vir区（virulence region）操纵子  转化所必需的基因有virA、B、C、D、E、G。其中蛋白VirD1/D2识别T-DNA边界RB和LB；VirC识别T-DNA右边界的超驱增强子；VirD2在T-DNA底链起内切酶作用造成切刻，并与T－链 5’ 共价结合，带有1个核定位信号NLS；VirB形成转移复合通道；VirE2为单链DNA结合蛋白，有2个NLS。该操纵子的表达顺序如下： virA和virG组成型表达形成VirA和VirG蛋白 →VirA被植物创伤信号分子激活→激活的VirA使VirG激活 →激活的VirG 诱导virC、D、E、B、F、H表达。 3. 农杆菌染色体基因组相关基因：chvA、chvB（农杆菌运动、附着）、chvD、chvE（编码单糖结合蛋白、趋化性）、pscA、att、cel（合成纤维素丝，附着）。它们与农杆菌的趋化性和识别附着植物细胞有关。 4. 寄主细胞表面受体 5. 诱导条件: 小分子酚类化合物：如乙酰丁香酮（AS，acetosyringone）、羟基乙酰丁香酮（OH-AS，hydroxyacetosyringone）；它们是植物细胞创伤反应的一部分，或创伤细胞合成木质素的一部分，是莽草酸合成途径的产物。植物细胞必须在创伤和活跃的代谢状态下才能产生AS及OH-AS。农杆菌对一系列植物酚类化合物具有趋化性，同时高浓度的AS又可使农杆菌的vir基因活化表达。这些化合物是双子叶植物细胞壁合成的前体，通常不存在于单子叶植物中，这正说明了为什么根癌农杆菌不易感染单子叶植物。若要实现农杆菌对水稻的转化，必须添加这类诱导物。 糖类：如D-葡萄糖、D-木糖等。它们在Vir区基因诱导和农杆菌毒力上起一定作用。 高浓度的肌醇可促进vir基因的表达。 低pH：pH 5.1－5.8 时Vir区基因的诱导达到最高水平。 合适的温度：25－28℃。virD及virG的活化必须低于28℃ 农杆菌转化的关键步骤包括： 农杆菌识别并定殖于植物细胞 植物受伤信号分子诱导农杆菌vir基因表达 T链形成 T复合体及毒性因子输入寄主胞质 T链进入寄主细胞核 T链整合至寄主基因组 T-DNA基因表达 转化成功与否、转化效率的高低，除了与上述因素有关外，还与植物材料本身的状态有关。一般要选择活力高、细胞分裂旺盛的材料作为转化受体。就水稻而言，授粉后12－15d的幼胚、幼胚及成熟胚来源的胚性愈伤组织均是很好的受体材料。 三、实验材料 水稻幼胚或胚性愈伤组织 含目的基因质粒的农杆菌（带有潮霉素抗性筛选基因hpt） 无菌滤纸 四、仪器设备及用具 （一）仪器设备 超净工作台 恒温摇床 培养箱 台式高速离心机 涡旋仪 抽滤器 高压灭菌锅 电子天平 酸度计 培养室 （二）用具 微量移液器 金属药匙 牙科手术钩或细菌涂布器 100mL无菌三角瓶 直径9cm培养皿 200?L及1mL tip枪头 枪形镊 五、试剂及培养基 （一）试剂 二甲基亚砜（DMSO） 乙酰丁香酮（AS） 头孢霉素（Cefazollin sodium） 羧苄青霉素（Carbenicillin sodium） 潮霉素（Hygromycin） 卡那霉素（Kanamycin） 链霉素（Streptomycin） （二）培养基 1. 水稻愈伤组织培养基 N6macro＋B5micro＋B5vit＋2,4-D 2 mg/L＋ CH 300 mg/L＋L-proline 500 mg/L＋ L-glutamine 500 mg/L ＋ sucrose 30g/L ＋ agar 7.5g/L pH5.8 2. 筛选培养基