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药典液相色谱方法的调整 • 根据药典附录“液相色谱法”规定，可调整适当参数 调整目的：满足系统适用性的要求 系统适用性的要求 HPLC方法调整的考虑因素 05版药典的系统适用性要求 1、理论塔板数： 反映整个色谱系统的状态 填料状态 管线连接 有不同的计算方法 主要是峰宽取值方法不同 不同计算方法计算结果有差异 影响因素： 被测组分的保留时间、进样量等 积分参数 系统死体积 测定色谱方法、样品与计算方法保持恒定，以便比较 05版药典的系统适用性要求 2 、分离度： 影响因素： * 影响柱效的因素 色谱柱尺寸 填料性能 进样量 * 影响分离选择性的因素 流动相组成 色谱柱品牌 柱温 * 柱外体积 有不同的计算方法，结果有差异 05版药典的系统适用性要求 3、重复性（进样精密度）： * 外标法：对照品溶液（n ：5 ） 峰面积RSD ：2.0% * 内标法：相当于80%，100%，120%的对照品溶液，加入规定量内标 溶液，分别至少进样2次，计算平均校正因子（n ：6 ） 校正因子RSD ：2.0% * 手动进样器：定量环（满环进样：进样体积至少为3倍定量环体积） 自动进样器：准确定量范围 05版药典的系统适用性要求 4 、拖尾因子： 影响因素： * 与理论塔板数相关的因素： 色谱柱选择、流动相、进样量、积分参数等 * 与检测品种与方法相关 * 峰高法定量分析：0.95~1.05 HPLC方法参数调整 • 用规定的对照品对色谱系统进行试验，应符合要求。 如达不到要求，可对色谱分离条件做适当的调整。 • 不得改变：固定相种类，流动相组成，检测器种类。 • 可改变：色谱柱尺寸，牌号，填料粒度，流动相流 速，流动相各组成的比例，梯度洗脱时间长度，柱 温，进样量，检测器灵敏度等 常见的液相色谱参数的调整：其他参数 • 柱温：升高柱温有利于改变峰形和分离度，但要注意柱的最高耐 受力 • 进样量：在满足检测要求的前提下，尽量减少进样量 • 供试品溶剂：溶剂强度应等同或低于流动相洗脱强度 • 反相色谱中溶解样品的溶剂： * 甲醇并不是良溶剂 * 推荐溶剂 最好是流动相 梯度最好为起始流动相 尽可能有水溶液参与 如果不得不用有机溶剂溶解，尽可能使用小进样量或两步稀释 常见的液相色谱参数的调整：流动相 • 改变溶剂比例：根据色谱柱类型与状态 • 添加剂 扫尾剂：有机胺 缓冲溶液：10-50mM；从20mM开始，越少越好 离子对试剂：平衡时间长，易在色谱柱中保留 • 缓冲液pH 酸含量 缓冲液的缓冲容量：pKa+-1 对方法耐用性的影响 常见的液相色谱参数的调整：固定相 • 关注不同品牌色谱柱的选择性差异 碱性化合物：封端柱、内嵌极性基团柱 pH耐受范围 耐受高水相柱：阿莫西林含量及有关物质的测定 • 关注色谱柱规格对分离的影响 长度： 内径：可决定流速 粒度：越小，柱效越高 孔径：与样品分子量大小相关 药品杂质分析：杂质定义 • 任何影响药品纯度的物质 • 在药品质量标准中的杂质系指在按照经国家有关药品 监督管理部门依法审查批准的规定工艺和规定的原辅 料生产的药品中，由其生产工艺和原辅料带入的杂 质，