050第五章细胞融合与单克隆技术探究.ppt

5. 表位印模选择技术： 用特定的已知抗原从抗体组合文库中或噬菌体抗体文库中筛选所需抗体，通过抗体可变区与抗原结合及编码轻、重链可变区鼠源性与人源性基因置换、匹配，从而获得能与抗原特异性反应的人源性抗体； 将筛选到的含人轻、重链基因的质粒转染到骨髓瘤SP2/0细胞中，该细胞即可产生人单克隆抗体。 四、单克隆抗体的应用 1. 理论研究： ? 构建B淋巴细胞杂交瘤可用于分析B细胞的多样性及其产生机理，并能分析免疫应答中抗体的多样性。 ? 利用单克隆抗体可进行表位分析：利用单克隆抗体的交叉反应，能帮助找出大分子之间在重要结构和生物学上的关系，因为对一种单克隆抗体起反应的几种大分子一定具有相同和相似的抗原决定簇。 2. 诊断试剂中的应用： ? 单克隆抗体现已广泛应用于许多领域的诊断，特别是在疾病诊断上广泛应用。如针对HIV、乙肝等疾病的单克隆抗体，测定妊娠的hCG单克隆抗体、测定排卵的LH单克隆抗体在市场上大量供应。 ? 用针对肿瘤细胞表面特异抗原的单克隆抗体在帮助诊断癌症，如用癌胚抗原(CEA)的单克隆抗体在帮助诊断结肠癌和直肠癌，用前列腺酸性磷酸酶的单克隆抗体在帮助诊断前列腺癌等。 ? 用同位素标记的单克隆抗体用于肿瘤显像定位对诊断肿瘤患者是否有转移病灶具有重要意义。 3. 疾病治疗上的应用： ? 在肿瘤、细菌、病毒、寄生虫和霉菌性疾病，自身免疫病、移植排斥以及解毒等方面，人们设想利用单克隆抗体进行治疗；其中在移植排斥和自身免疫病、细菌感染等方面已有成功的报道； ? 单克隆抗体有可能作为体内应用的单克隆靶向制剂的载体，与同位素、药物、毒素、细胞因子等可杀死肿瘤细胞的物质交联，使这些物质能够准确到达肿瘤细胞所在的部位，针对性杀死肿瘤细胞达到治疗疾病的目的。 本章小结 细胞融合：又称体细胞杂交，是指在外力作用下，两个或两个以上的细胞或原生质体相互接触，从而发生膜融合、胞质融合和核融合并形成同种多倍体或杂种细胞的现象。 诱导细胞融合的方法主要有：病毒诱导法(如仙台病毒)、化学诱导法(如聚乙二醇)和电融合法 (直流电脉冲)等方法。 可以利用酶缺陷型、营养缺陷型、温度敏感性、形态和行为等标志，对融合细胞进行筛选。最常用的是酶缺陷型HAT选择培养法。 HAT选择培养法的原理是氨基喋呤(A)可阻断核苷酸的“从头合成”途径，细胞只能通过“补救途径” 合成DNA。在“补救途径”中，细胞在HGPRT或TK激酶作用下，分别将利用次黄嘌呤(H)和胸腺嘧啶核苷(T)转化为肌苷酸和脱氧胸苷来合成DNA。因此，一个HGPRT－或TK－的细胞株在含HAT的培养液中不能生长而逐渐死亡。 HGPRT－或TK－酶缺陷型细胞只有与能提供HGPRT或TK酶的正常细胞相融合，产生的杂交细胞才能在含HAT培养液中存活下来。 融合的细胞可以用有限稀释克隆法、琼脂培养基克隆法、毛细胞克隆法、荧光激活分选法等方法进行克隆化培养。 细胞融合在单克隆抗体制备、基因定位、遗传基因的缺陷互补、分化功能的表达调控、细胞核移植等方面发挥重要的功能。 利用细胞融合技术可将产生特定抗体的B淋巴细胞与骨髓瘤细胞进行融合，得到既可分泌抗体又能无限增殖的杂交瘤细胞，从而产生针对某一抗原的单克隆抗体，该技术称为单克隆抗体技术。 单克隆抗体的制备主要以下步骤：动物的免疫、脾细胞分离、骨髓瘤细胞的准备、细胞融合、融合细胞的筛选与克隆、单克隆抗体的大量制备等技术过程。 由于大多数单克隆抗体是鼠源性的，在人类疾病的治疗中会产生人抗鼠反应。对抗体进行改造获得人源性抗体或基因工程抗体以减少人抗鼠反应。 人源性单克隆抗体技术包括：EB病毒转化技术、人—鼠杂交瘤单克隆抗体、人—人杂交瘤单克隆抗体、构建转人Ig基因组小鼠、严重免疫缺陷小鼠制备单克隆抗体等。 基因工程抗体技术包括：人—鼠嵌合抗体、改型抗体、抗体片段、噬菌体抗体文库技术、表位印模选择技术等。 单克隆抗体在基础研究、疾病的诊断和治疗、单克隆抗体靶向制剂等方面上具有重要的意义。 重点与难点 细胞融合常用技术及其原理 融合细胞筛选常用的方法与原理 HAT选择法的技术原理 制备单克隆抗体的主要技术步骤 人源化抗体和基因工程抗体主要技术 思考题： 简述细胞融合技术的主要方法与技术原理。 简述筛选融合细胞的主要方法与原理。 简述单克隆抗体的制备过程及主要原理。针对某一抗原物质A设计一个研究方案，并制备相应的单克隆抗体。 HAT的选择原理是什么？ 利用细胞工程制备人源性单克隆抗体的方法主要有哪些？它们的优势与难点何在？ 简述单克隆抗体在临床诊疗中的应用。 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维