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一 大肠杆菌感受态细胞的 制备及转化 掌握的内容(pET28a-GFP) 1.制备和转化涉及到的概念(感受态，感受态细胞，转化等) 2.制备和转化方法，转化过程 3.原理 4.转化过程中可能出现的问题及问题分析 二 转化子的培养和质粒的提取 1.转化子培养中，一般常见抗生素的储存浓度和工作浓度(Amp 和 Kana) 2.碱裂解法提质粒：步骤以及注意事项等，所用到的试剂的组成以及每种试剂作用【分离时用到的溶液I II III组分和作用，纯化是用到的酚氯仿等比例和浓度，沉淀DNA用到的无水乙醇和70%乙醇的作用，溶解质粒DNA用到的TE的成分（加了RNase A ）】。。。。 3.会看质粒的图谱 质粒图谱分析 三 质粒的酶切 1.涉及的概念和原理 2.酶切图谱的分析 3.酶切不成功的原因分析 限制性内切酶，酶的活性单位等 pET28a-GFP双酶切后片段（700bp和 5200bp左右，酶切可能出现的三种结果（单切，双切，两个酶都没起作用） 四 PCR 1.PCR原理及过程（PCR定义） 2. PCR体系的建立（各个成分的作用） 2.PCR程序的设定 3.PCR的影响因素（分析PCR不成功的原因） 4.PCR的图谱分析 五 琼脂糖凝胶电泳 1.电泳的过程及方法（制备琼脂糖凝胶） 2.电泳的原理（电泳的影响因素：DNA分子大小、构象、琼脂糖凝胶的浓度、电压等，点样时我们用到的SDS上样缓冲液的组成以及作用） 五 GFP蛋白的表达 1.涉及到的概念和方法（实验的方法，先将质粒转化到表达菌株BL21（DE3） ，然后加IPTG诱导表达得到的GFP蛋白） 2.GFP在大肠杆菌BL21（DE3）中能够诱导表达的原理 * 题目一 GFP蛋白的基因克隆及表达 以pEGFP为模板，以设计的特定寡核苷酸为引物，利用PCR获得GFP的片段 空质粒 重组质粒 重组质粒分子量变大而在电泳中滞后 1 2 3 4 1 Marker 从上到下 100bp， 200bp， 300bp， 400bp，500bp， 600bp，700bp，800bp，900bp，1000bp，1500bp 酶切的图谱 800bp左右和5200bp左右的两个片段 质粒的图谱 6000bp左右，这三条不同构象的条带在电泳凝胶上的位置要按具体情况而定，不会分的这么开，图上画的不怎么准确 4 PCR检测的条带 710bp左右 pET-28a-GFP质粒大小、质粒酶切后片段大小、PCR检测片段大小计算过程，电泳图结果见ppt前一页 题型： 1 名词解释 10分 (2分*5) 2 选择 20分 (2分*10) 3 填空 10分 (2分*5) 4 判断改错 15分 (1.5分*10) 5 简答 30分 (6分*5) 6 论述 15分 (15分*1) 分子生物学实验 GFP 绿色荧光蛋白的基因克隆及表达 * * * 绿色荧光蛋白黄色红色
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