发酵过程多尺度优化案例分析(郭美锦)分解.ppt

PIP PDI1 KAR2 蛋白伴侣基因的转录差异分析 PIP蛋白的合成通量也随拷贝数的增加而增加了 0 6 18 0 6 18 PIP GLR1 TRR1 抗氧化基因的转录差异分析 高拷贝菌株可能受到氧化胁迫 0 6 18 0 6 18 H2O2，ROOH，· OH ROS GSH PIP 活性氧（ROS）水平 胞内ROS和GSH水平 AOX1 FLD1 DAK 甲醇代谢途径关键酶基因的转录差异分析 高拷贝菌株甲醇代谢途径发生显著变化 0 18 6 0 18 6 PIP 0 18 6 PIP ZWF1 PYK2 PDH GAP CIT1 中心代谢途径关键酶基因的转录差异分析 AOX1 PIP DAK CIT1 ZWF1 FLD PDH PYK2 GAP GLR1 TRR1 PDI1 KAR2 ROS GSH 低拷贝菌株关键酶转录水平变化（与空白菌比） 1.43 3.14 AOX1 PIP DAK CIT1 ZWF1 FLD PDH PYK2 GAP GLR1 TRR1 PDI1 KAR2 ROS GSH 0.35 0.73 0.79 0.34 1.80 2.74 3.14 6.78 1.75 1.68 高拷贝菌株关键酶转录水平变化（与空白菌比） 氧化胁迫 甲醇代谢显著变化 高拷贝菌株中，甲醇代谢途径的变化，使得由于细胞合成的碳源和能源供应不足，因此细胞生长缓慢；同时也表明PIP蛋白的翻译可能是蛋白表达的限制性因素 为什么高拷贝菌株中甲醇代谢途径发生变化？ 拷贝数对毕赤酵母生理代谢影响的转录差异分析 拷贝数增加 蛋白合成量增加 蛋白氧化折 叠通量增加 胞内GSH大量消耗 酵母代谢甲醛能力降低 细胞调控通过降低甲醇通量来减少胞内甲醛积累 细胞碳源能源供给不足 （PDI1，KAR上升） （GSH水平下降） （ROS上升） （AOX1下降，FLD上升） 甲醇-YE混合补料 18-copy 拷贝数对毕赤酵母生理代谢影响的转录差异分析 AOX1 PIP DAK CIT1 ZWF1 FLD PDH PYK2 GAP TRR1 PDI1 KAR2 1.30 2.18 1.54 3.58 1.64 1.65 2.66 1.36 GLR1 3.76 YE补加后高拷贝菌株关键酶转录水平变化 传感技术应用 尾气在线质谱技术 在线显微观察仪 活细胞量在线测定技术 原位红外光谱检测技术 基于稳定同位素13C的细胞微观代谢通量检测技术 总结 寻找关键生理参数 优化操作参数 人有了知识，就会具备各种分析能力， 明辨是非的能力。 所以我们要勤恳读书，广泛阅读， 古人说“书中自有黄金屋。 ”通过阅读科技书籍，我们能丰富知识， 培养逻辑思维能力； 通过阅读文学作品，我们能提高文学鉴赏水平， 培养文学情趣； 通过阅读报刊，我们能增长见识，扩大自己的知识面。 有许多书籍还能培养我们的道德情操， 给我们巨大的精神力量， 鼓舞我们前进。 * * * * * 发酵过程多尺度优化案例 郭美锦 华东理工大学 中国 上海 青霉素发酵曲线 基因工程菌红霉素发酵曲线 303-09-433批基因工程菌代谢过程曲线(接种量10.7%) 发酵中期（70-90h）随着补糖速率的快速上升，RQ上升，OUR、CER出现第二高峰，即“二次生长”。 阿维菌素发酵过程曲线 发酵过程优化与放大是 一个令人困惑的问题？ 背景 直接参数 物理参数 化学参数 成熟 不成熟 搅拌 间接参数 生 理 参 数 案例分析:多拷贝毕赤酵母发酵 毕赤酵母（Pichia pastoris） 猪胰岛素前体(Porcine insulin precursor,PIP) 毕赤酵母研究背景 毕赤酵母简介： 经过二十多年的发展，毕赤酵母表达系统已发展成为外源蛋白表达最常用的表达系统之一，已有超过五百种蛋白在该系统中成功表达。 毕赤酵母表达系统特点： 真核系统 受甲醇严格调控的强启动子（PAOX1，PGAP，PFLD等） 成熟的高密度培养技术 高外源蛋白表达量（无论是胞内还是胞外表达） 外源蛋白基因遗传高稳定性 重组蛋白表达策略 高密度 防蛋白降解 分泌效率 翻译效率 转录水平 高拷贝数 高表达 Typical profiles of Pichia pastoris with MutS