负性共刺激分子B7-H4与PI3KAKT信号通路相关性和机制的研究.pdfVIP

负性共刺激分子B7-H4 与PI3K/AKT 信号通路相关性及机制的研究 中文摘要 负性共刺激分子B7-H4 与PI3K/AKT 信号通路相关性及 机制的研究 中文摘要 B7-H4 分子是B7 家族共刺激分子家族的一员，能负性调控T 细胞免疫反应。早 期的研究证明，B7-H4 是跨膜蛋白，参与调节免疫反应。本实验室的前期研究发现， B7-H4 分子含有核定位序列（NLS ），能够穿梭于细胞质与细胞核之间。细胞膜上表 达的B7-H4 分子已被证实可通过抑制T 细胞的增殖来促进肿瘤的生长，而对细胞核 B7-H4 分子的研究并不多见，个别研究发现，细胞内 B7-H4 分子与细胞的增殖和凋 亡相关。磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B (PI3K/AKT)信号通路与细胞的生长、增殖和 肿瘤的发生、发展密切相关，并且会参与细胞内一些蛋白分子的转位。研究发现， B7-H4 可以通过抑制活化T 细胞中的AKT 信号通路，影响T 细胞的增殖，但是，对 于PI3K/AKT 信号通路对B7-H4 亚细胞定位的调节作用尚不清楚。 本研究旨在构建 B7-H4 野生型与核定位序列突变型稳定转染的细胞株，初步研 究各稳转细胞株的生物活性，并以野生型 B7-H4 稳转细胞株为研究对象，通过控制 PI3K/AKT 信号通路的活性，探讨其与B7-H4 亚细胞定位的关系。 本论文主要包括以下两部分内容： 一、人B7-H4 基因转染细胞株的构建及其生物学功能的初步研究 【目的】构建B7-H4 WT/293 、B7-H4 H250Q/293 和Mock/293 稳定转染细胞株， 并对其生物学功能进行初步研究。 【方法】将野生型B7-H4 基因（B7-H4-WT ）、突变体B7-H4 基因（B7-H4-MT ） 和真核质粒 pIRES2-EGFP 基因用脂质体共转染法分别转染进入 HEK/293 细胞，经 G418 加压筛选，分别用流式细胞术鉴定稳定转染细胞株，通过免疫荧光观测经LMB 处理后的B7-H4 WT/293 和B7-H4 H250Q MT/293 中B7-H4 定位情况，并通过体外增 殖率分析实验和SCID 鼠异种移植成瘤实验检测各转基因细胞的体内和体外增殖率。 【结果】构建了三株稳定转染的细胞株：B7-H4 WT/293 、B7-H4 H250Q/293 和 Mock/293 ，免疫荧光结果验证了人B7-H4 核定位序列的存在，对体内和体外生物学 I 中文摘要 负性共刺激分子B7-H4 与PI3K/AKT 信号通路相关性及机制的研究 功能的研究显示，细胞核B7-H4 对细胞增殖有促进作用。 【结论】成功构建了三株稳定转染的细胞，为进一步研究细胞核B7-H4 的作用 机制提供了有效地研究工具。 二、PI3K/AKT 信号通路对B7-H4 亚细胞定位调节作用的研究 【目的】探讨磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶 B (PI3K/AKT)信号通路对负性共刺 激分子B7-H4 亚细胞定位的调控作用。 【方法】体外培养稳定转染B7-H4 WT/293 细胞株，采用PI3K/AKT 特异性抑 制剂LY294002 处理细胞后，免疫荧光技术结合激光共聚焦显微镜检测B7-H4 蛋白在 B7-H4 WT/293 细胞中亚细胞定位的变化；Western blot 法检测分别用PI3K/AKT 信号 通路抑制剂LY294002 、PI3K/AKT 信号通路活化剂IGF-1、PI3K/AKT 信号通路下游 mTORC1 抑制剂Rapamycin 和PI3K/AKT 信号通路下游MDM2 抑制剂Nutlin-3 处理 后，B7-H4 蛋白在细胞膜、细胞质和细胞核中量的变化。 【结果】激光共聚焦显微镜观察结果显示，PI3K 抑制剂LY294002 作用于B7-H4 稳定转染的B7-H4 WT/293 细胞株后，与空白对照组相比，B7-H4 发生核转移，加入 出核转运抑制剂LMB 后，核转移的程度显著增加；Western blot 结果显示，LY294002 抑制PI3K/AKT 信号通路活性24h 后，B7-H4 在细胞膜和细胞质中的定位均显著性