物化学技术2 沉淀法.pptVIP

2.凝集素 目前研究得比较清楚的是植物血球凝集素，如伴刀豆蛋白，它是一种特殊的蛋白质，主要对糖蛋白糖链末端序列有特异、明显的凝集力 例：伴刀豆蛋白—对含有G、甘露糖等分子的糖蛋白能发生特异凝集沉淀作用，通过离心可把糖蛋白与一般蛋白质分离开，获得的凝集素-糖蛋白复合物用单糖作抑制剂即可解离 优点：条件温和，专一性强 3.重金属 重金属（Pb2+、Hg2+）也能与蛋白质沉淀，纯化Pro。但由于重金属易使Pro变性，故应用时要控制在较温和的条件下进行，并及时除去重金属 * (四)PEG沉淀法 此法应用较广,属于非离子型聚合物引起的Pro沉淀作用;沉淀条件温和，不易引起Pro变性，且沉淀较完全 如用20%PEG-6000或57%PEG-400可使α-葡萄糖苷酶80%发生沉淀 * （五）选择性沉淀 利用目的Pro与杂Pro在不同物理化学环境下的稳定性不同（如温度、酸碱度、有机溶剂等），用选择性沉淀法，使杂Pro变性沉淀，而目的Pro存在于溶液中或发生可逆性沉淀，从而使目的Pro得到纯化 例：①酵母干粉抽提液升温至55℃，20min后迅速冷却，离心除去热变性的Pro，上清液中为对热稳定的醇脱氢酶 ②假单胞菌培养液中加 HCl 调pH至4.0，得到碱性脂酶的沉淀 * （六）结晶沉淀法 操作： ①将欲结晶的物质溶解于适当溶剂中，加入适量的盐（如20~40% （NH4）2SO4 ）或有机溶剂（如EtOH、MeOH等），使其溶解度降低至接近饱和的临界浓度或刚刚开始出现沉淀 ②调节pH至等电点附近，控制温度4℃左右，使溶解度进一步降低 ③放置一段时间（陈化），即可得到结晶沉淀 对于难结晶的物质，有时采用加入少量“晶种”引子，或进行适当搅拌，或在容器 壁上用玻棒磨檫等方法，可加速结晶 * 三、制备核酸 从生物材料（如动物组织、线粒体、叶绿体，以及微生物中的真菌、细菌和病毒等）中分离出的DNA或RNA，往往是以DNA- Pro（DNP）或RNA- Pro（RNP）复合物的形式存在的，所以制备核酸样品时，首先需使复合物解聚，释放出核酸，除去Pro，然后用沉淀法得到核酸 * （一）DNP/RNP复合物的解聚 在破细胞溶液中，加入适量的阴离子去污剂SDS或十二烷基肌氨酸钠、脱氧胆酸钠DOC、聚氧乙基十六烷基酚醚、TWeen等，使DNP/RNP解聚释放出核酸 加入适量醋酸钾溶液沉淀SDS-pro和SDS-K+等，然后离心除去沉淀 分离上清，即为初步纯化的核酸制品 1.加去污剂 * 2.加有机溶剂 用有机溶剂反复处理抽提液，直至处理液经离心后，水相-有机相界面交接出无变性的pro为止 注意有机溶剂的祛除——一般用乙醚提取，再在低温蒸馏除净乙醚 * 3.蛋白酶处理 用蛋白水解酶除去复合物中的pro组分，此法条件温和，一般不会造成对核酸的破坏 常用的pro水解酶有：溶菌酶、蛋白酶K、蛋白酶E等 * （二）消除多糖等杂质 1.多糖 抽提前用“饥饿法”可减少生物材料中贮存多糖（如淀粉、糖原等）的含量 混杂于核酸提取液中的多糖类杂质，一般用异丙醇、十六烷基三甲基溴化铵（CTAB，适用于酸性多糖）等选择性沉淀剂除去；此外，也可用等体积2.5mol/L磷酸缓冲液和等体积乙二醇甲醚处理，经离心，多糖位于中部，核酸位于上层乙二醇甲醚中 * 2.DNA与RNA的分离 ①盐析法 DNA：易溶于1~2mol/LNaCl溶液，难溶于0.14 mol/LNaCl溶液 原理 RNA：易溶于0.14 mol/LNaCl溶液，难溶于1~2mol/LNaCl溶液 例：从小牛胸腺提取DNA：用0.14 mol/LNaCl溶液反复洗涤、绞碎、离心；结果RNA存在于溶液，DNA存在于沉淀中 ②酶水解法 在提取DNA时，用RNase水解RNA， RNase中混有的DNase用100℃热 处理15min 在提取RNA时，用DNase水解DNA， DNase中混有的RNase，在Ca2+存在条件下，加蛋白酶K作用或加碘乙酸钠处理，使RNase破坏 * （三）核酸沉淀 在核酸溶液中加入某些有机溶剂或非离子型聚合物试剂时，核酸会被有效地沉淀 * 1.有机溶剂沉淀法 ①乙醇—盐溶液 操作：在核酸溶液（＞0.1μl/ml）中加入0.1mol/L NaCl 和2倍量体积（DNA）或2.5倍体积（RNA）的冷无水乙醇，就可将核酸沉淀出来 注意：沉淀时间与温度、核酸分子大小、浓度有关 DNA＞1kb时，室温数