免疫染色玉手箱 总论.pdf

パラフィン切片を用いた免疫組織染色の結果の解釈 東京医科大学病理診断学 向井 清 免疫組織化学、特に酵素抗体法は病理診断や形態学的研究に広く用いられている。免疫組織化 学は生体内の物質（抗原）の存在 と分布を生物試薬（抗体、酵素）を用いて高感度に、かつ特異 性高く検出する方法である （表１）。その特徴として１）手技的に易しい、２）応用範囲が広い （生 化学的情報→形態情報）、３）生物学的、病理学的に重要な情報を提供する、４）生物学的試薬を 用いるので通常の方法 とは異なった注意がいる、などがあげられる。免疫組織化学染色は新鮮凍 結切片から細胞診検体、固定組織のパラフィン切片まで検体の種類をあまり選ばないという長所 もある。 酵素抗体法による免疫染色は通常の病理診断に用いられるホルマリン固定パラフィン包埋組織 が使えるために、その応用範囲は非常に広い。しかし、ホルマリン固定組織であるために起こり うるアーチファクトなどに十分な注意を払わないと染色に失敗したり、あるいは染色結果の解釈 を誤ることがある（表２）。 結果の解釈には二面性がある。まず一般的な DAB で発色したときに茶色に染色されている部 分が本当に陽性であるのか。ホルマリン固定組織を用いた場合には多くのアーチファクトにより、 偽陽性や偽陰性が生じ うる。従って染色自体が陽性であるのかどうかをきちんと検定する必要が ある。次に陽性である場合あるいは陰性である場合、それが生物学的にどうい う意義があるのか を明らかにする必要がある。 表１ 酵素抗体法で染色可能な抗原 ・細胞の産生/分泌物 ・増殖細胞抗原 ・細胞特異抗原（分化マーカー） ・癌遺伝子産物 ・ホルモン/ ホルモンレセプター ・病原微生物 ・細胞間基質 ・免疫複合体など 表２ パラフィン切片を用いる際の留意事項 ・固定/包埋による抗原の変化 ・検出法の感度 ・抗体の浸透 と反応性 ・結果の解釈 A. 染色の感度、特異性など まず、ホルマリン固定組織について回る諸問題について解説する。 Ⅰ．固定の影響とそれに対する対策 組織の固定は自己融解を止め、組織や細胞の形態を保持すると ともに、抗原が細胞内や組織内 で移動することを防ぐために行われる （表３）。通常の組織学的検索に用いられるホルマリン固定 は形態の保持には優れているが、抗原性の保持という点からは理想的な固定液とはいえない。そ こでホルマリン以外にもアルコールなどが固定液として用いられているが、形態保持に優れ、す べての抗原の抗原性を保存できるような固定法はまだない。ホルマ リン固定組織では染色が不可 能あるいは困難な抗原があり、常に偽陰性という可能性がついて回る。固定の影響について十分 な理解がないと結果の解釈を正しくできないことも起こりうる。 固定の影響を克服するにはいくつかの方法が考えられる。まず、ホルマリン固定の影響を受け ないエピトープを認識する抗体を用いるとい うことが考えられる。現在は実に多くのモノクロー ナル抗体が入手可能となり、一つの抗原を認識する抗体でも、認識するエピトープは異なってい るものが多く作製されている。その中で固定の影響を受けにくいエピトープを認識する抗体を選 択することにより、偽陰性を減らすことが可能となる。 ２番目の対応としてホルマリン固定によ り抗体との反応性が減弱した抗原の反応性を賦活化す るという方法がある （表４）。この方法のはしりは 1970 年代に導入された消化酵素を用いた切片 の消化による方法（Protease-induced epitope retrieval, PIER）である。トリプシン、ペプシン などによる切片の消化が免疫染色の前に行われた。この方法は有効な場合もあるが、酵素の力価