染色质免疫沉淀（chip）实验指南 - 纽普生物.pdfVIP

上海纽普生物科技有限公司 公司网站： 染色质免疫沉淀（ChIP ）实验指南  ChIP 基本原理  ChIP 一般流程  ChIP 实验步骤  ChIP 注意事项  ChIP 常见问题及解决方法 1 上海纽普生物科技有限公司 公司网站： ChIP 基本原理 ChIP 是在活细胞状态下固定蛋白质-DNA 复合物，并将其随机切断为一定长度范围内的染色质小片段，然后通 过免疫学方法沉淀此复合体，特异性地富集目的蛋白结合的 DNA 片段，通过对目的片断的纯化与检测，从而获得 蛋白质与DNA 相互作用的信息。ChIP 不仅可以检测体内反式因子与DNA 的动态作用，还可以用来研究组蛋白的各 种共价修饰与基因表达的关系。而且，ChIP 与其他方法的结合，扩大了其应用范围：ChIP 与基因芯片相结合建立的 ChIP-on-ChIP 方法已广泛用于特定反式因子靶基因的高通量筛选；ChIP 与体内足迹法相结合，用于寻找反式因子的 体内结合位点；RNA-ChIP 用于研究RNA 在基因表达调控中的作用。由此可见，随着ChIP 的进一步完善，它必将会 在基因表达调控研究中发挥越来越重要的作用。 ChIP 一般流程 甲醛处理细胞→收集细胞，超声破碎→加入目的蛋白的抗体，与靶蛋白-DNA 复合物相互结合→加入 ProteinA ， 结合抗体-靶蛋白-DNA 复合物，并沉淀→对沉淀下来的复合物进行清洗，除去一些非特异性结合→洗脱，得到富集 的靶蛋白-DNA 复合物→解交联，纯化富集的DNA- 片断→qPCR 分析。 在qPCR 分析这一块，比较传统的做法是半定量-PCR。但是现在随着荧光定量PCR 的普及，纽普生物建议使用 qPCR ，更能反映实验结果。 此外，RIP 其实就是用ChIP 的方法研究细胞内蛋白与RNA 的相互结合，具体方法和ChIP 差不多，只是实验过 程中要注意防止RNase 对RNA 的降解，最后分析的时候需要先将RNA 逆转录成为cDNA ；ChIP-ChIP 其实就是ChIP 富集得到的DNA- 片段，拿去做芯片分析，做法在ChIP 的基础上有所改变，不同的公司有不同的做法，要根据公司 的要求来准备样品。 ChIP 实验步骤 以下介绍的经典操作流程需要三天时间。 第一天： （一）、细胞的甲醛交联与超声破碎。 1、取出1 平皿细胞（10cm 平皿），加入243 μl 37% 甲醛，使得甲醛的终浓度为1%（培养基共有9ml ）。 2 、37℃孵育10min。 3 、终止交联：加甘氨酸至终浓度为0.125M 。450 μl 2.5M 甘氨酸于平皿中。混匀后，在室温下放置5min 即可。 4 、吸尽培养基，用冰冷的PBS 清洗细胞2 次。 2 上海纽普生物科技有限公司 公司网站： 5 、细胞刮刀收集细胞于15ml 离心管中（PBS 依次为5ml ，3ml 和3ml ）。预冷后2000rpm 5min 收集细胞。 6 、倒去上清。按照细胞量，加入SDS Lysis Buffer 。使得细胞终浓度为每200 μl 含2 ×106 个细胞。这样每100 μl 溶液含 1 ×106 个细胞，再加入蛋白酶抑制剂复合物。假设 MCF7 长满板为5 ×106 个细胞。 本次细胞长得约为 80%满度，即为4 ×106 个细胞。因此每管加入400 μl SDS Lysis Buffer 。将2 管混在一起，共800 μl。 7 、超声破碎：VCX750 ，25%功率，4.5s 冲击，9s 间隙。共14 次。 （二）、除杂及抗体哺育。 8 、超声破碎结束后，10,000g 4℃离心10min。去除不溶物质。留取300 μl 做实验，其余保存于-80℃。300 μl 中，100 μl 加抗体做为实验组；100 μl 不加抗体做为对照组；100 μl 加入4