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なが い たか こ 氏 名 永 井 貴 子 学位論文題目 N-acetyl-seryl-aspartyl- lysyl-proline inhibits diabetes-associated kidney fibrosis and endothelial- mesenchymal transition （N-acetyl-seryl-aspartyl- lysyl-proline は糖尿病に関 連した腎線維化と内皮－間葉系分化を抑制する） 学位論文内容の要旨 研究目的 糖尿病性腎症は最終的に腎線維化を生じ末期腎不全へと進行する。腎線維化において重 要とされる線維芽細胞の活性化やその供給源としてEndMT(内皮細胞-間葉系細胞分化)の 意義が注目されている。N-acetyl-seryl-aspartyl-lysyl-proline (AcSDKP)はアンギオテ ンシン変換酵素(ACE)によって分解される内因性ペプチドであるが，様々な実験モデルに おいて抗線維化効果を示すことが報告されている。本申請者らはAcSDKP の抗線維化効果 において, Transforming growth factor(TGF)- βおよびその特異的細胞内転写因子Smad 経路への影響を報告しているが, 近年micro RNA let-7 の腎保護効果，及び，その発現が fibroblast growth factor 受容体(FGFR)発現に関連するとする報告がある。本研究では, この抗線維化ペプチドAcSDKP の，線維芽細胞活性化，EndMT，腎線維化に対する抑制効果 を確認するとともに，その分子機構を明らかにし，臨床応用を見据え，既存の糖尿病性腎 症治療薬との併用で相加的効果の有無について明らかにすることを目的とする。 実験方法 実験①糖尿病性腎症治療薬 ACE 阻害薬投与下のAcSDKP による相加的抗線維化効果を調べ るために、生後6 週CD1 マウスにstreptozotocin(STZ)(200mg/kg)を腹腔内へ単回投与し, STZ 誘導 1 型糖尿病腎症モデルマウスを作成, その時点から4 カ月後にACE 阻害剤（ACE- I）のイミダプリル単独あるいはACE-I＋AcSDKP の追加投与，または アンギオテンシン受 容体拮抗薬のTA-606 単独を各々マウスに投与した。各マウス群の薄切腎組織を用い，PAS 染色にて糸球体硬化を調べ，MTS 染色にて尿細管間質線維化を評価した。他方でマウス血 漿および尿中の AcSDKP 濃度を測定した。EndMT 過程を調べるために薄切腎組織に対して 内皮マーカーCD31 及び間葉系マーカーαSMA およびFSP1 染色を行い，二重染色陽性細胞 をEndMT 過程の細胞と認識して蛍光顕微鏡で解析した。 実験② AcSDKP による抗 EndMT 効果の in vitro 解析を行うために、ヒト培養内皮細胞 (HMVEC)を用い，サイトカイン(TGF- β2，TNF- α，IL-1β)で刺激，2 時間の AcSDKP 前孵 置 （100nM）を行い, 計 72 時間の培養後，AcSDKP の有無によって比較検討し、さらに蛍 光抗体法によりCD31 及び SM22 αの発現を調べ, Western blot 法によってCD31,VE カド ヘリンとFSP1 さらにSmad3 の蛋白発現を検討した。 実験③ AcSDKP による抗EndMT 効果におけるmicroRNA let-7 family 制御機構及び let- 7 の標的TGF βR1 についての検討を行った。糖尿病モデルマウス凍結腎臓サンプルを用 いてmicroRNA を含むtotal RNA を抽出後，microRNA array 解析, 定量的PCR を施行し, let-7 family を解析した。Western blot 法により FGFR リン酸化，FGFR 蛋白量を解 析し、また薄切腎組織を用い，let-7 の標的であるTGF βR1 とCD31 を二重染色し，蛍 光顕微鏡で解析した。