转铁蛋白及其融合蛋白的表达 - core.pdf

转铁蛋白及其融合蛋白的表达、纯化及活性鉴定 转铁蛋白及其融合蛋白的表达、纯化与活性鉴定 摘 要 人转铁蛋白（TF ）是一个能够结合铁的单体糖蛋白，主要生理功能 库 为结合、运输三价铁离子,控制体液中游离铁离子浓度，提供可利用的铁 要 和防止铁在血液中的沉积。成熟的转铁蛋白由679 个氨基酸组成，分子量 约80 kD，可分为性质相似的两个结构域TFN 和TFC。人转铁蛋白受体是 摘 II 类糖蛋白二聚体，主要分布于肿瘤细胞、血脑屏障和快速增生组织， 文 在人小肠组织中也大量存在。据文献报道TF 与胰岛素偶联复合物可以促 进胰岛素口服吸收，降低血糖。我们构建了甲状旁腺激素（PTH ）－TFN 论 融合蛋白，探索利用TFN 作为载体介导甲状旁腺激素跨细胞膜运输的可能 士 性。 硕 利用 PCR 技术分别从保存的基因质粒中克隆出人甲状旁腺激素和人 转铁蛋白基因，通过重叠PCR 技术将PTH 基因与TF 基因及其基因片段 博 融合。融合基因和单独表达的转铁蛋白及其基因片段克隆至原核表达载体 学 pET22-b 、真核表达载体pPIC9 中，转化相应的宿主菌BL21(DE3)和GS115 。 所构建的重组菌在摇瓶内诱导表达。SDS分析发现只有转铁蛋白的 大 N 端（TFN ）及甲状旁腺激素－转铁蛋白的N 端(PTH-TFN)能够在巴斯德 门 毕赤酵母GS115 中表达。对表达上清进行SDS分析，筛选到高表 达菌株。巴斯德毕赤酵母工程菌pPIC9-PTH-TFN/GS115 在摇瓶内表达量 厦 约40 mg/L ，5 升发酵罐中表达量约100 mg/L。初步纯化的PTH-TFN 和 TFN 经薄层凝胶扫描纯度大于90% 。Western Blotting 表明PTH-TFN 能与 PTH 单抗发生免疫反应。铁饱和试验证明PTH-TFN 没有改变TFN 与铁结 合能力。这说明融合蛋白没有破坏PTH 和TFN 各自原有结构。Caco-2 单 - １ - 厦门大学硕士学位论文 层细胞模型是一种常用的研究药物口服吸收模型。利用此模型证明 PTH-TFN 能够跨细胞膜转运，说明TFN 作为跨细胞膜转运载体，可以促 进PTH 通过肠道吸收进入体内。 关键词：甲状旁腺激素；转铁蛋白；巴斯德毕赤酵母；基因表达 库 要 摘 文