CXCR4启的条件复制型腺病毒联合DAL-1转染人羊水干细胞对肺癌的治疗作用.pdfVIP

CXCR4 启动的条件复制型腺病毒联合DAL-1 转染人羊水干 细胞对肺癌的治疗作用 中文摘要 研究背景与目的 肺癌是当今世界上发病率最高的恶性肿瘤，其最主要的致死原因是肿瘤的远 处转移。DAL-1是一个抑癌基因，我们在前期试验中证明了DAL-1基因参与肺癌 的增殖和转移过程的调控，由此提示DAL-1可作为肺癌的治疗靶点。 腺病毒载体是最常用的基因治疗载体，在临床应用中其面临两大瓶颈：免疫 原性强和缺乏靶向性。鉴于其靶向性差，学者提出条件复制性腺病毒的概念。条 件复制性腺病毒能够选择性地在肿瘤细胞中完成感染和复制周期，从而特异性溶 解肿瘤细胞，却不伤及正常组织。条件复制性腺病毒目前最需解决的问题是，如 何提高驱动腺病毒复制的启动子的肿瘤靶向性。CXCR4是趋化因子SDF-1的特异 性受体，研究指出CXCR4在超过20种不同类型肿瘤中有表达，而在非肿瘤组织 中几乎不表达，另外CXCR4启动子也被证实了在肝脏中的低毒性，因此CXCR4 启动子是较理想的肿瘤特异性启动子。 间充质来源干细胞已被证实具有免疫原性低的特性和肿瘤归巢能力。人羊水 干细胞属于间充质来源干细胞的一种，其取材安全、不涉及伦理道德问题和无成 瘤性，有望成为理想的干细胞种子来源，人羊水干细胞现主要应用与再生领域， 然而关于利用人羊水干细胞治疗恶性肿瘤的研究却鲜有报道。 综上所述，为增强条件复制性腺病毒的靶向性和杀伤力，本研究拟构建一个 新的载体Ad-CXCR4-DAL-1并转染人羊水干细胞。利用CXCR4启动子能特异性 使腺病毒在靶细胞内复制并溶解靶细胞，DAL-1能特异性抑制肿瘤细胞生长和促 进凋亡，人羊水干细胞具有免疫原性低和肿瘤归巢的特性，旨在通过构建的特异 性双靶向溶瘤病毒载体，降低腺病毒对非靶器官的毒副作用，联合抑癌基因以提 高对肿瘤细胞的杀伤效应，利用人羊水干细胞携带Ad-CXCR4-DAL-1以降低腺病 毒免疫原性，定点归巢于肿瘤局部，从而提高对肿瘤的靶向杀伤效应，为基因治 万方数据 疗提供一种新的策略。 方法 一、条件复制型腺病毒载体Ad-CXCR4-DAL-1 和Ad-CXCR4-GFP 的构建： 构建重组质粒pAdxsi-CXCR4-DAL-1 和pAdxsi-CXCR4-GFP，利用293 细胞包装 成条件复制型腺病毒 Ad-CXCR4-DAL-1 和 Ad-CXCR4-GFP ；TCID50 法测定 Ad-CXCR4-DAL-1 和Ad-CXCR4-GFP 滴度。 二、CXCR4 在 A549 细胞内启动活性的检测、条件复制型腺病毒 Ad-CXCR4-DAL-1 转染A549 细胞后复制数和DAL-1 表达的检测：荧光定量PCR 检测5 种肺癌细胞株CXCR4mRNA 表达，筛选出表达最高的A549 细胞；将构 建的Ad-CXCR4-DAL-1 （实验组）、Ad-CXCR4-GFP （对照组）和Ad-NULL （空 载体组）分别转染至A549 细胞中，荧光定量PCR 检测各组E1AmRNA 、E4 DNA 和DAL-1 mRNA 表达；Western Blot 检测各组DAL-1 蛋白的表达。 三、条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1 功能的检测：实验分四组：实验 组、对照组、空载体组和空白对照组。流式细胞仪检测各组分别转染A549 细胞 和16HBE 细胞后的凋亡率；CCK-8 实验检测各组分别转染A549 细胞和16HBE 细胞后的细胞毒性，计算各组细胞活性率。 四、条件复制型腺病毒Ad-CXCR4-DAL-1 体内抑瘤作用的检测：实