关于2生物样品的预处理.pptVIP

蛋白杂质的影响及对策 多糖提取液中除去蛋白质是一个很重要的步骤，常用的方法有 Sevag法 氯仿：戊醇（或正丁醇）：多糖水溶液=5：1：6 较温和 三氟三氯乙烷法 多糖水溶液：三氟三氯乙烷=1：1 效率高、不易大量应用 三氯乙酸法 多糖水溶液中滴加3%三氯乙酸 较剧烈，不适合含呋喃糖残基的多糖 酶解法 前三种方法不适合糖肽的分离 三氯醋酸法和Sevag法的脱蛋白效果相近，并且蛋白酶法与Sevag法相结合除蛋白的效果较好。 * 1.2 动物组织预处理注意事项 匀浆化前的预处理(冷冻) 提取物缓冲液的选择(中性) 蛋白酶抑制剂的添加 保护剂的添加(β-巯基乙醇、EDTA、辅酶等) 提取液的澄清( 高速离心、沉淀、吸附等) * 1.3 微生物物质的提取制备 各种发酵产品，由于菌种不同和发酵液特性不同，其预处理方法的选择也有所不同。 大多数发酵产物存在于发酵液中，也有少数产物存在于菌体中，或发酵液和菌体中都含有。 对于胞外产物，经预处理应尽可能使目的产物转移到液相，然后经固液分离除去固相； 对于胞内产物，则应首先收集菌体或细胞，经细胞破碎后，目的产物进入液相，随后再将细胞碎片分离。 * 大肠杆菌重组蛋白的提取制备 多拷贝质粒上强启动子过量表达重组蛋白质使整个细胞的蛋白质表达水平提高,但大多情形下会导致诸如包含体的不溶性蛋白聚集的形成 重组菌E. coli M15(pQE32-AGN)外源基因的诱导表达(A未诱导，B诱导) * 包含体 包含体（inclusion bodies）是无定形的蛋白质的聚集，不被任何膜所包围。细胞破碎后，包含体呈颗粒状，致密，低速离心就可以沉淀。 包含体难溶于水中，在变性剂溶液（如盐酸胍、脲）中才能溶解。在这些溶液中，溶解的蛋白质呈变性状态，即所有的氢键、疏水键全被破坏，疏水侧链完全暴露，但一级结构和共价键不被破坏。因此当除去变性剂时，一部分蛋白质可以自动折叠成具有活性的正确构型，这一折叠过程称为蛋白质的复性。 包含体主要由蛋白质构成，其中大多是基因表达产物。这些基因表达产物没有生物活性。为此，欲获得天然活性态的目标产物，必需分离包含体后，溶解包含体并使其中的目标蛋白恢复应有的天然活性。所以，包含体的出现增加了生化工程师生物分离设计的难度 * 重组蛋白的提取步骤 大肠杆菌的酶解 采用溶菌酶或超声破碎方法来破壁 包含体的清洗 用溶剂清洗包含体能进一步除去杂蛋白 从包含体中溶解重组蛋白（变性） 选择和优化溶解液（一般为尿素和盐酸胍），使包含体中重组蛋白溶解 重组蛋白的复性 稀释法、透析法、层析法、分子伴侣等 * 2 细胞的破碎与分离 细胞的破碎： 用一定方法（机械法、物理法、化学法、酶法等）打开细胞壁或膜，使细胞内含物有效地释放出来。 提取： 目的物从胞内转移到外界溶液中。 细胞 提取剂 提取液（液体目的物） 沉淀洗涤提取物（固体目的物） 破碎 匀浆 离心 * 2.1 细胞的破碎方法 2.1.1 机械法 原理：机械运动产生剪切力的作用破细胞 组织捣碎法 适合：硬度较大的动、植物组织 * 高速匀浆法 特点 破碎程度高，而其机械剪切力对生物大分子的破坏较少，处理量大。 原理 利用高压使细胞悬浮液通过针性阀，由于突然减压和高速冲击撞击环使细胞破裂。 适用 较柔软、易分散的组织细胞 * 高速匀浆机 高速匀浆法为大规模细胞破碎的常用方法，设备由高压泵和匀浆阀组成。 * 研磨法与珠磨法 研磨法(实验室规模) 由陶瓷的研钵和研杆组成，加入少量研磨剂（如精制石英砂、玻璃粉、硅藻土） 珠磨法(工业规模) 进入珠磨机的细胞悬浮液与极细的玻璃小珠、石英沙、氧化铝等研磨剂（直径1 mm）一起快速搅拌或研磨，研磨剂、珠子与细胞之间的互相剪切、碰撞，使细胞破碎,释放出内含物。在珠液分离器的协助下，珠子被滞留在破碎室内，浆液流出从而实现连续操作。 适用：微生物（细菌）与植物细胞 * 珠磨机 卧式珠磨机 立式珠磨机 * 挤压法 微生物细胞在高压下通过一个狭窄的孔道高速冲出，因突然减压而引起一种空穴效应，使细胞破碎。 适用：细菌（革兰氏阴性菌） * 2.1.2 物理法 超声波破碎 频率为20kHz以上的波，超过人耳可听范围。其对细胞的破碎与空穴的形成有关。 空穴作用：在超声波作用下，使气泡形成、胀大和破碎的现象。 一般样品浓度、声强、频率、介质的离子强度、pH、处理时间都对破碎有影响。 微生物细胞条件: 样品浓度50～100mg/ml，输出功率100～200W，破碎时间3～5分钟，间歇操作，样品量≤40ml，冰浴操作 * 超声破碎仪 * 渗透压冲击法 高渗突然低渗，反复后可造成细胞破碎，促使内含物释放。 适用：处理胞壁较脆