TIM-3在脓毒血症中的免疫调节和其机制研究.pdf

I IMMUNOREGULATORY ROLE AND ITSMECHANISMS OF TIM-3IN SEPSIS A Dissertation Submitted to the GraduateSchool of HenanUniversity in Partial Fulfillment of the Requirements for the Degree of Masterof Medicine By Yang Xiaomei Supervisor: Prof. Ma Yuanfang Prof. Han Gencheng May,2013 I I 摘 要 背景:T 细胞免疫球蛋白粘附分子-3 （T cell Ig and mucin domain protein 3,Tim-3 ） 最初被发现于活化的 Th1 、Th17 、Tc1 效应细胞上，与其天然配体半乳糖结合蛋白-9 （Galectin-9，Gal-9 ）结合后可诱导T 效应细胞的凋亡，下调免疫反应，诱导免疫耐受。 然而随着研究的深入，人们发现Tim-3 也表达在DC 、巨噬细胞等天然免疫细胞上，并 参与天然免疫的调节。由于Tim-3 在天然免疫和适应性免疫反应中均具有重要的作用， 所以它的表达失调与很多临床疾病相关。Tim-3 的低表达与T 细胞功能增强的自身免疫 性疾病有关，如多发性硬化和自身免疫性肝炎；Tim-3 的过表达与T 细胞功能丧失相关 的疾病有关，如肿瘤或慢性细菌性感染。脓毒血症是由感染诱发的全身性过度炎症反应。 据统计全球每年有1800 万人发病，在非休克患者中，其死亡率为30 ％—40 ％，而在休 克患者中其死亡率则高达70%—90% 。即便在发达国家如美国，一年就有近25 万脓毒 血症死亡病例。脓毒血症发病率仍存在上升的趋势，但目前尚缺乏有效的诊治手段。另 外有越来越多的数据显示，参与天然免疫反应的Tim-3 具有免疫自稳调节的功能。Tim-3 是否能够促进脓毒血症的免疫自稳，成为治疗脓毒血症的新措施，目前还不清楚。 目的:Tim-3 在天然免疫和适应性免疫应答中起非常重要的免疫调节作用，探究该 分子在脓毒血症中的可能免疫调节作用及其机制。 方法:1、收集脓毒血症患者血标本，观察不同病情患者 Tim-3 表达情况；构建经 典脓毒血症动物模型—盲肠结扎穿刺术，观察模型发病过程中Tim-3 的动态变化；给予 Tim-3 单抗或者Tim-3 融合蛋白，观察Tim-3 通路阻断后，CLP 生存率和脾脏细胞因子 变化情况。 2 、观察Tim-3 单抗对CLP 腹腔巨噬表达细胞细胞因子的影响；观察CLP 不同严重程度时，腹腔巨噬细胞表达Tim-3 情况；观察稳定低/高表达Tim-3 RAW264.7 细胞系的吞噬能力及其对TLRs 激动剂的反应性。 3、检测RAW264.7 细胞系/小鼠腹腔 巨噬细胞受到不同浓度LPS 或不同时间点LPS 刺激后，Tim-3 表达情况； Tim-3 单抗 对LPS 模型脾脏细胞因子的影响；Tim-3 单抗对TLR4-KO-CLP 的生存率和脾脏细胞因 子影响。 结果:1、与轻度脓毒血症患者相比，重症患者外周血中表达Tim-3 下降；CLP 模 II 型随着时间的延长，Tim-3 表达呈先升高后下降的趋势，并且与 sham 相比，CLP 小鼠 Tim-3 表达下降；给予Tim-3 单抗或者Tim-3 融合蛋白，Tim-3 通路阻断，CLP 生存率 下降，脾脏细胞因子 （IL-1 β、IL-6、TLR4 等）均呈现上升趋势。2、Tim-3 单抗阻断 CLP 体内Tim-3 通路后， CLP 腹腔巨噬表达细胞细胞因子呈升高趋势；与sham 相比， CLP 小鼠腹腔巨噬细胞表达Tim-3 下降；观察稳定低/高表达Tim-3 RAW264.7 细胞系的 吞噬能力及其对TLRs 激动剂的反应性，发现Tim-3 表达下降时细胞系的吞噬能力提高， 对TLRs 的