三个品种猪肠道β-防御素表达及特性分析.pdf

Anhui Agricultural University Master Dissertation β-defensin gene expression and characterization in intestine of three varieties of porcine Candidate： Shao Chang-sheng Supervisor ： Qi Ke- zong Academic Degree applied for ： Master of Medicine Major ： Nutrition and Food Hygiene Direction ： Quality and safety of food of animal origin College： College of Tea and Food science June 2013 项目资助 安全猪肉生产一体化关键技术研究与产业化示范 (安徽省教育厅自然科学重点项目 编号KJ2011A122） 摘要 防御素作为哺乳动物先天性免疫和获得性免疫的重要组成部分，具有抗菌谱 广、抗菌能力强、作用机制独特等特点，成为生物学科领域当前研究的热点。猪 β-防御素在粘膜上皮细胞和白细胞中大量分布，是机体抵抗外界病原微生物的首 次屏障，是先天性免疫的重要因子。 为了探索不同品种猪之间肠道防御素表达水平与定位检测，本研究以皖南花 猪、皖南黑猪、杂交猪为研究对象，应用实时荧光定量 PCR 技术检测不同品种 猪之间肠道 β-防御素表达，利用原位杂交技术进行 β-防御素在肠道内的原位表 达检测，成功从皖南黑猪肠道粘膜内分离纯化出具有抑菌活性的抗菌肽。具体研 究内容和结果如下： 1、猪不同肠段β-防御素的表达水平比较 根据GenBank 中登记的猪β 防御素(pBD-1、pBD-2 、pBD-3)序列设计保守序 列特异性引物，从小肠中提取总 RNA ，采用一步法反转录后，测序比对，并应 用实时荧光定量 PCR 技术检测比较不同肠段防御素的表达。结果表明：皖南黑 猪、皖南黑猪 β-防御素序列保守。在 3 个肠段中，回肠中 β-防御素基因表达量 最高，在品种间表达差异上，皖南黑猪β-防御素在小肠上表达量极显著高于杂交 猪和皖南花猪 （p0.01 ）。说明β-防御素在品种间存在一定的差异性。 2 、猪肠道β-防御素的原位表达 选取具有表达类型代表性的 pBD-1 和 pBD-2 ，设计寡核苷酸探针，采用 SABC-FITC 荧光标记，检测 β- 防御素在猪肠道中的原位表达。结果表明： pBD-1mRNA 在粘膜上皮和粘膜下层有杂交信号，而pBD-2mRNA 表达在粘膜下 层和固有层有杂交信号。 3 、猪小肠抗菌肽的分离纯化和抑菌实验 采用冰醋酸浸提法、离子交换层析技术对皖南黑猪小肠粘膜抗菌肽提取物进 行分离提取纯化，应用琼脂糖弥散法对抗菌肽提取物进行抑菌实验，使用 Tricine-SDS电泳对纯化产物进行分子量测定，通过标准曲线法检测纯化 物的蛋白浓度。结果表明：所得的高纯度抗菌肽对大肠埃希菌和猪肠道分离沙门 氏菌有较高的抑菌作用，测定蛋白浓度为0.15mg/mL 。 以上研究表明，本实验初步探索比较不同品种猪肠道β-防御素的表达，及其 mRNA 基因在肠道中的原位表达检测，得出在回肠中 β-防御素表达量最高，皖 南黑猪各肠段表达水平极显著高于其余2 个品种，并从皖南黑猪小肠内成功分离 纯化出对大肠埃希菌和猪肠道分离沙门氏菌有较高抑菌作用的抗菌肽。 关键词：皖南黑猪，皖南花猪，杂交猪，小肠，β-防御素，特性分析 I Abstract Defensins is an most i