一株产凝乳酶枯草芽孢杆菌的筛选鉴定和N+注入选育.pdf

摘要 干酪生产中应用的凝乳酶主要有三类，包括动物凝乳酶、植物凝乳酶和微生物 凝乳酶，评价凝乳酶优劣的两个重要指标是凝乳活力和蛋白水解力。近年来，由于 世界干酪产量逐年上升，对凝乳酶的需求也不断增大，因此，来源广泛、价格低廉 的微生物凝乳酶日益受到人们的重视。 目前产凝乳酶菌株的诱变选育的研究大多集中在霉菌，对细菌的研究报道较 少。本研究以市售干酪为原料，从中分离出一株产凝乳酶的菌株，采用生理生化特 征分析和 16SrDNA 序列分析的方法对菌株进行鉴定，在此基础之上采用低能氮离子 束注入法对该菌株进行诱变，探究离子注入诱变技术选育高产凝乳酶菌株的可行 性，并对诱变菌株的发酵条件及其酶活性进行了初步研究。 实验一：从市售美兰干酪中分离筛选，得到一株产凝乳酶活性良好的菌株，其 凝乳活力 750SU/mL，蛋白水解活力 1.86U/mL 的菌株，其凝乳活力和蛋白水解活力 比值为 403.23，凝乳效果及气味良好；凝乳质地光滑，硬度适中；呈乳黄色，均匀 有光泽。 实验二：运用形态学观察、常规生理生化鉴定和 16SrDNA 鉴定的方法，通过构 建菌株系统进化树，鉴定该菌株为一株枯草芽孢杆菌。 + 实验三：采用 N 注入法对筛选出的菌株进行诱变，确定最佳诱变条件为能量 15 2 20keV、剂量 2.08×10 ions/cm ，获得一株特性优良的诱变菌株 XCYB-6，其凝乳 活力达到 2181.82SU/mL，比出发菌株提高 1.9 倍，蛋白水解活力为 2.53U/mL，凝乳 活力与蛋白水解活力的比值高达 862.38。传代（6 代）实验表明，诱变菌株具有良 好的遗传稳定性。 实验四：在单因素发酵试验基础之上进行旋转正交试验，建立凝乳酶生产发酵 工艺中葡萄糖浓度、牛肉膏浓度、装液量和接种量对凝乳酶活性的数学模型。获得 优化发酵条件为：葡萄糖浓度 15g/L，牛肉膏浓度 5.0g/L，装液量 50mL，接种量 3.5%，凝乳酶活实际可达到 3055SU/mL。 实验五：通过酶活性试验研究表明该凝乳酶在酸性条件下具有较高的酶活，pH 在 5.5 时酶活性最高； 45℃为该凝乳酶的最适凝乳温度；随着保温时间的延长，凝 乳活力和蛋白水解活力都呈现下降的趋势，温度越高，下降的趋势越大；该酶对光 比较稳定；最适的底物浓度为 10%；钙离子、亚铁离子和镁离子对凝乳活力有较显 著地激活作用，其中钙离子的激活作用最为明显，钠离子、钾离子和氯离子对凝乳 活力的影响不显著，而铜离子和锌离子对凝乳活力有轻度的抑制作用。 I 关键词：枯草芽孢杆菌，凝乳酶， 鉴定，离子注入诱变，工艺优化