包埋脱水法超低温保存条斑紫菜自由丝状体的研究.pdfVIP

第31卷第2期 辽宁师范大学学报(自然科学版) Vo1．31 No．2 2008年 6月 Journal of Liaoning Normal University(Natural Science Edition) Jun． 2008 文章编号：1000—1735(2008)O2一O217一O4 包埋脱水法超低温保存条斑紫菜自由丝状体的研究 王起华， 曹光辉， 梁 宏， 张恩栋， 谷 月 (辽宁师范大学 生命科学学院，辽宁大连 116029) 摘 要：将2个品种的条斑紫菜自由丝状体(Porphyra yezoensis Ueda 03B和03C)分别包埋在含3％褐藻酸钙的胶 球中，探讨了脱水速率、胶球含水量及恢复方法对冷冻保存存活率的影响．结果表明；含条斑紫菜03B丝状体的胶球以 15 含水量／h的脱水速率脱水至15 含水量，经过冷冻保存并在培养基中暗恢复 24 h后，丝状体的存活率可达 82．4 ．而含条斑紫菜03C丝状体的胶球在以7．5 含水量／h的脱水速率脱水至25 含水量后直接培养时，丝状体 的冷冻保存存活率最高，为80．9 ．与常规的两步法相比，包埋脱水法可大大简化操作程序，并可获得较高的存活率， 是冷冻保存条斑紫菜自由丝状体的一种有潜力的方法． 关键词：条斑紫菜；自由丝状体；包埋脱水法；冷冻保存；存活率 中图分类号：Q945．78；Q949．29 文献标识码：A 紫菜营养丰富，味道鲜美，具有多种药用和保健功能，还可作为工业原料加以利用，具有重要的经济价值 ．目前我 国紫菜产量已占全世界的1／4，列世界第三，在海藻养殖中占有重要地位 ]．而其中条斑紫菜的产量在人工养殖的大型 海藻中仅次于海带，居于第二位[ ．条斑紫菜自由生长的丝状体是人工养殖紫菜的一种重要形式，从自由丝状体可以培 养出具有相同遗传性状的叶状配子体[ ．近 1O多年来，有关条斑紫菜种质超低温保存的研究日益受到重视．陈国宜等 。 曾探讨过条斑紫菜果孢子的冷冻保存，Kuwano等[ 则详细研究了条斑紫菜自由丝状体的两步法冷冻保存技术．采用上 述常规冷冻保存技术保存条斑紫菜种质虽然取得了较高的存活率，但是需要特殊的降温设备，采用较为复杂的冷冻程序 和使用对生物材料有害的抗冻保护剂，因而在一定程度上限制了该技术的广泛应用 ．玻璃化法和包埋脱水法分别是上 世纪8O年代末和9O年代初建立的两种超低温保存新技术，具有不需要昂贵的降温设备，冷冻程序比较简单等优点，目 前这两种新技术在高等植物的种质保存中已显示出巨大的应用潜力[7-s3．近年来，包埋脱水法已先后用于藻类的冷冻保 存并取得了初步成功[9 ．然而，采用包埋脱水法保存条斑紫菜种质的研究迄今尚未见报道．本文采用包埋脱水法研究 了脱水过程中的脱水速率、胶球含水量及化冻后的恢复方法等因素对条斑紫菜自由丝状体冷冻保存的影响，以探求超低 温保存条斑紫菜种质的一条新途径． 1 材料与方法 I．I 材料及其培养 条斑紫菜(Porphyra yezoensis Ueda 03B和03C)自由丝状体由中国科学院海洋研究所实验海洋生物学重点实验室 提供．无菌条件下培养在装有 150 mL PES培养基[ 的250 mL三角瓶中．培养条件为(18士1)℃，冷荧光，光强 33 mol photen m s_。，光周期L：D一14：10． 1．2 包埋和脱水 1．2．1 包埋 取上述培养材料，用消毒海水再悬浮至适当密度(1 g鲜重材料／lO mL消毒海水)，与含3O‰NaC1的6％ 褐藻酸钠溶液等体积混匀，将此混合液滴人含0．1 mol／L CaC1 的无磷PES培养基中，3O min后得到直径约为3 mm的 胶球，具体方法参见王起华等[”]，略有改动．将此胶球置于PES培养基中，在与材料培养相同温度下暗恢复培养2 d． 1．2．2 脱水及含水量的测定 取上述包埋后的胶球 9O个称鲜重后烘干，再称干重．另将胶球每3O个为一组用硅胶吸 湿法脱水至一定时间后测定胶球重量，并由此计算出脱水后的胶球含水量．方法参见王起华等 ”]． 1．3 冷冻及化冻 将上述脱水后的胶球每1O个为一组放人2 mL冻存管内，密封后直接投入液氮中保存．24 h后将冻存管投入3O℃ 恒温水浴中迅速振荡，直至胶球表面白色变为