细胞组分的分析方法.ppt

第三章 细胞生物学研究方法 本章主要介绍了细胞形态结构的观察方法、细胞组分的分析方法、以及细胞培养和细胞工程方面的技术与研究。 重点：各种显微镜的最基本的工作原理和主要应用领域；细胞组分的分离与纯化方法要点和应用领域；细胞培养和细胞工程等实验技术的基础知识 难点：几种显微镜(光镜与电镜)的工作原理；电镜制样技术；几种新的细胞组分分析方法 考点分析 本章主要考查各类方法技术的原理及用途,考查形式多样。 光学显微镜技术主要考查分辨率及其影响因素,各种特殊显微镜的基本特点及应用范围. 电子显微镜技术则在设计原理及类型、样品制备技术(超薄切片、负染色、冰冻蚀刻、免疫电镜技术)的原理及应用方面以简答题形式为主. 考点分析 细胞内各种化学成分的定性、定位和定量分析技术、细胞化学与组织化学法、免疫细胞化学法、各种分光光度术、放射自显影和分子杂交技术等,考查的形式多以实验设计为主进行考查. 目录 第一节 细胞形态结构的观察方法 第二节 细胞组分的分析方法 第三节 细胞培养、细胞工程与显微操作技术 第四节 用于细胞生物学研究的模式生物 第一节 细胞形态结构的观察方法 本节主要内容： 一、光学显微镜技术 二、电子显微镜技术 三、扫描隧道显微镜 一、光学显微镜技术（light microscopy) ?(一)普通复式光学显微镜技术 ?(二)相差显微镜（phase-contrast microscope） ?(二)微分干涉显微镜 （differential interference contrast microscope, DIC） ?(二)录像增差显微镜技术（video-enhance microscopy） ?(三)荧光显微镜技术（Fluorescence Microscopy） ?(四)激光共焦扫描显微镜技术（Laser Confocal Microscopy） ?(五)荧光共振能量转移技术(36) ? (六)荧光漂白恢复技术 (一)普通复式光学显微镜 1. 普通复式光学显微镜组成 2. 普通光镜的成像原理 3. 普通光镜的应用优缺点 1.普通复式光学显微镜组成 判断题：在使用光学显微镜时，如果物镜不变，用10倍的目镜时的分辨率比用5倍的目镜高1倍。（ ） 比较放大率和分辨率的含义。 总结:物镜已经分辨清楚地细微结构，假如没有经过目镜的再放大，达不到人眼所能分辨的大小，那就看不清楚。但物镜所不能分辨的细微结构，虽然经过高倍目镜的再放大，也还是看不清楚。所以目镜只能起放大作用，不会提高显微镜的分辨率。 3.普通光镜的应用优缺点 优点：操作简便、样品制备简便、成本低 缺点：分辨率较低，图像反差小 应用：应用领域极为广泛，主要用于观察被检物的细微结构。 (三)荧光显微镜技术 1.技术原理 2.结构性能 3.应用 1.技术原理 强光源发出紫外光和蓝紫光， 经过滤光系统， 照射到样品， 激发样品中的荧光物质发出可见荧光， 通过物镜和目镜放大成像， 观察和摄像 2.结构性能 (1)荧光光源---------高压汞灯、氙灯 (2)滤色系统 a.激发滤光片----选择激发光的波长 b.阻断滤光片----吸收或阻挡激发光进入目镜，防止成像干扰和保护眼睛 (3)光路系统 由光源、滤色系统、集光镜、反光镜、物镜和目镜等组成 3.应用 观察物质结构，应用 于地质、医学、生物 学等。是目前对特异 蛋白质等生物大分子定性定位研究的最有力工具。 荧光显微镜技术包括:荧光素直接标记技术 和间接免疫荧光标记技术 优点：图像清晰，灵敏度高，细胞内物质可做特异性观察与分析 (四)激光扫描共焦显微镜技术(Laser Scanning Confocal Microscopy、LCM) 1.原理：激光源经过双色镜反射，经物镜后汇聚到样品(预先经免疫荧光标记)的某一焦点，从焦点发出的荧光经过透镜汇聚成像并被检测器检出,而非焦点区的荧光不能汇聚成像。 逐点、逐行、逐面快速扫描成像，扫描的激光与荧光收集共用一个物镜，物镜的焦点即扫描激光的聚焦点，也是瞬时成像的物点。 系统经一次调焦，扫描限制在样品的一个平面内。调焦深度不一样时，就可以获得样品不同深度层次的图像，这些图像信息都储于计算机内，通过计算机分析和模拟，就能显示细胞样品的立体结构。 2.应用：观察亚细胞结构如内质网膜系统和细胞骨架系统等细胞内的复杂网络。 激光共聚焦扫描显微镜既可以用于观察细胞形态，也可以用于细胞内生化成分的定量分析、光密度统计以及细胞形态的测量。 3.优点：A.通过共聚焦可进行光学切片，观察较厚样品内部结构，排除焦平面以外光的干扰，增强