人MxA转基因克隆猪之制作及初步分析.docVIP

　　人MxA转基因克隆猪之制作及初步分析 第一篇文献综述 第 1 章 MxA 抗病毒蛋白的研究进展 当病毒侵染宿主时，动物自身的免疫系统会迅速应答以抵抗抗原的复制。其中由 I 型干扰素 IFNalpha;/beta; 诱导产生的 Mx 蛋白是抵抗病毒感染过程中最有意义的决定因子之一。这种具有 GTP 酶活性的抗毒蛋白广泛存在于脊椎动物，属于含有亮氨酸锌指结构的高度保守的蛋白。MxA 蛋白具有广谱的抗病毒作用，对多种 RNA 病毒和一些其它病毒均有明显的抑制作用，具有极大的临床应用价值和广阔的研究前景。 1.1Mx 蛋白的发现 Horisberger 等证实这种抗毒作用只受 IFNalpha;/beta; 调节，而非 IFNgamma; 调节，继而通过 2D 电泳分析了 IFNalpha;/beta; 诱导后的细胞，发现多出一条大小为 75kd 的多肽，于是将这种多肽统一命名为 Mx 蛋白[3]。后来又发现，诱导后得到的多肽为混合物，可分为两种 MxI 和 MxII 蛋白，其中 MxII 没有抗毒活性[4]。人的 Mx 基因也能表达与小鼠类似的同源 MxA 和MxB 两种蛋白，MxB 蛋白无抗病毒活性[5-6]。经深入研究，人们现在证明活化的Mx 蛋白具有 GTP 酶活性，是动力蛋白超家族中的一员[7]。固有的 GTP 酶活性与的抗病毒作用的发挥密切相关，能够使 Mx 蛋白多聚体与病毒蛋白形成复合物并具有水解作用[8]。 1.2MxA 蛋白的结构 人体内，Mx 蛋白由第 21 号染色体编码，经 I 型 IFN 诱导通过 JAK/STAT 路径可产生 78kD 大小的 MxA 和 MxB 蛋白，人类的 MxA 基因也被称作干扰素诱导蛋白 p78（IF178）这两种蛋白都布于胞质中[9]。MxB 蛋白目前研究未发现有抗病毒活性，而 MxA 蛋白具有广谱的抗病毒作用，是继寡腺苷酸合成酶(OAS)和蛋白激酶 PKR 之后发现的又一种抗病毒蛋白，与前两者同属 IFN 下游基因，是构成天然免疫屏障的强力抗毒因子。 1.2.1MxA 蛋白的结构 活化的 Mx 蛋白有较强的 GTP 水解特性，属于 IFN-诱导的大 GTP 酶，与细胞内病原的控制有关[10-11]。包括有免疫相关 P47GTP 酶和鸟苷酸结合蛋白(GBPs)都可以抑制入侵的细菌和原虫的生长。动力蛋白样 GTP 酶可介导包括膜重塑在内的许多基本的细胞进程，由于序列相似程度和生化及结构性质，Mx 蛋白的功能与许多 GTP 酶超家族的其他成员极为相似[4]。MxA 蛋白分子量较大约为 78kd，表达过程中能够进行自我装配。MxA 蛋白与多数动力蛋白样 GTP 酶家族中的其它成员有在结构上有很高的相似性，在GTP 效应区约有 30-40%的序列与其它成员相同。MxA 含有一个约由 300 个氨基酸组成氨基末端 GTP 酶结构域，一个中间结构域(MD)约含有 150 个氨基酸，和一个羧末端GTP酶效应结构域(GED)约含有100 个氨基酸[10,12]。高度保守的GTP结合基序存在于氨基末端，而 MD 结构域及 GED 末端区域在蛋白的相互作用中起着重要作用，能产生两性分子双螺旋作用的 2 个亮氨酸锌指结构亦在此区。与动力蛋白类似，人 MxA 也为四聚体，与鸟苷酸亲和性较低，同时具有依赖于浓度的寡聚能力和应急装配 GTP 酶的活性[11,13]。尽管 MxA 蛋白属于大分子 GTP酶的动力蛋白超家族，但它与标准的 GTP 酶动力蛋白并不完全相同：MxA 蛋白不含有富含 SH3 结合位点的精氨酸-脯氨酸结构；MxA 也没有典型动力蛋白膜结合域所含有的同源结构[10,14]。基于电镜下 MxA 和动力蛋白寡聚物外表的相似性和介导寡聚化的氨基酸残基序列的相似性，目前研究已确定 MxA 存在更高级的网状球形结构，该结构由可以折叠为四个螺旋束的 MD 和 GED 的 N 末端组成，有可能是发挥 GTP 酶水解和抗病毒功能的基本结构单元[8,15]。在此基础上，德国科学家 Otto haller[2,4,8,10]等提出了 MxA 的晶体结构模型，推测三级结构可能由一个球状的 GTP 结合域和由多个螺旋结构组成的向外延伸的羧端效应域组成。MxA 蛋白的自我装配及与识别、结合相应靶结构的的功能由至少三个效应结构来完成，分别是氨基末端自装配序列（SAS）、中央活性区（CID）和前述的亮氨酸锌指结构（LZ）。通过点突变 LZ 近端第 612 的碱基会导致 MxA 突变体丧失自我寡聚合与 GTP 酶水解的能力[7]，说明作为效应区的 LZ 与 GTP 酶功能的发挥有关。 第二篇研究内容 第 1 章 MxA 真核表达载体的构建 干扰素系统是在病毒感染后立即启动的宿主细胞防御系统。干扰素发挥其抗病毒活性要激活至