蛋白质磷酸化修饰的最新研究方法.PDFVIP

蛋白质磷酸化修饰的最新研究方法 作者：钟丹丹博士 摘要 蛋白质磷酸化尤其是酪氨酸磷酸化对细胞的调控发挥重要的作用。本文概述了磷酸化研究的一些相 关的实验方法以及提高这些实验灵敏度的技巧，包括磷酸化蛋白Western Blot 检测、磷酸化蛋白质组学 和蛋白质酪氨酸激酶活性分析。 引言 对于信号转导科研来说，抗酪氨酸磷酸化抗体 的出现是一个意义重大的事件。在没有抗酪氨酸磷 蛋白质磷酸化对于许多生物现象的引发是很 酸化抗体之前，蛋白质和酶的酪氨酸磷酸化只能通 必要的，包括细胞生长、增殖、泛素（ubiquitin） 过非常危险的并且很费时的放射性实验来检测。而 介导的蛋白降解等过程。特别是酪氨酸磷酸化，作 利用抗酪氨酸磷酸化抗体，则可以通过 Western 为细胞信号转导和酶活性调控的一种主要方式，通 Blot 或其它免疫学方法轻松地检测到磷酸化信号。 常通过引发蛋白质之间的相互作用，进而介导生长 常规的检测方法包括：用抗酪氨酸磷酸化抗体在 因子、荷尔蒙和细胞因子等对细胞膜上受体的信号 Western Blot 上检测内源或外源表达的磷酸化蛋 调控。 白。如果目标蛋白的含量较低，也可利用免疫沉淀 然而，酪氨酸磷酸化在细胞的所有磷酸化修饰 的方法先富集发生磷酸化的酪氨酸蛋白，再检测目 中所占的比例却非常低。大概 10%的细胞蛋白会 标蛋白的水平。抗酪氨酸磷酸化抗体也常用于检测 受到磷酸化共价修饰，但每 100 次蛋白的磷酸化 在不同处理的条件下，细胞内总的酪氨酸磷酸化水 修饰中仅有1 次酪氨酸基团的修饰。与大部分细胞 平的变化情况，作为许多细胞生物现象的一个重要 中的丝氨酸和苏氨酸磷酸化水平相比，酪氨酸磷酸 指标。 化的水平估计要低2000 倍。正是由于细胞中酪氨 我们都知道如果需要检测某一个目标蛋白的 酸磷酸化的水平相当低，才能保证细胞在内外信号 某一特定位点的磷酸化状态，可以选用该蛋白特定 的刺激下，作出灵敏的反应，所以研究酪氨酸的磷 位点的磷酸化特异性抗体。但由于我们研究的通常 酸化对于细胞信号的调控和许多重要生物现象的 是新的磷酸化位点，或者这些蛋白特定位点的磷酸 研究具有极为重要的意义，而对发生酪氨酸磷酸化 化抗体效果不够好，我们不得不自己制备磷酸化抗 的蛋白质的识别及磷酸化位点的鉴定对揭示细胞 体。如果大家自己制备过磷酸化抗体，就会知道磷 过程的调控和药物的作用位点起到非常重要的作 酸化抗体的制备比一般抗体的制备更加困难，而且 用。 浪费大量宝贵时间。现在国外的科学家发现可以使 研究蛋白质磷酸化的相关方法： 用通用型的磷酸化抗体，只要巧妙的设计实验，也 磷酸化Western Blot ： 可以达到同样的检测目的。以Yuan 的文章为例，