农杆菌介导的ZmAChE基因对大豆的遗传转化研究.docVIP

　　农杆菌介导的ZmAChE基因对大豆的遗传转化研究 第 1 章 绪 论 1.1植物乙酰胆碱酯酶的研究进展 乙酰胆碱是一种神经递质，能够传导动物和昆虫突触连接的电刺激。在突触前神经元末端，电脉冲引起囊泡胞外分泌释放乙酰胆碱(ACh, acetylcholine)。之后，乙酰胆碱结合突触后神经元表面的乙酰胆碱受体，乙酰胆碱与受体的结合诱导了后来的突触后神经元的电脉冲。电脉冲的消失通常与乙酰胆碱受体上的乙酰胆碱的分解有关，乙酰胆碱酯酶(AChE，acetylcholine esterase)水解 ACh 并使它失活，电脉冲逐渐消失[1-3]。从而调控突触递质的浓度[3]。乙酰胆碱和乙酰胆碱水解酶活力已在植物中得到验证[4-7]。而且，在多种植物物种组织中证明了乙酰胆碱转移酶参与了乙酰胆碱的合成[8-9]。研究发现植物细胞中乙酰胆碱受体的存在，如在菜豆属豆苗[10]的膜碎片和小球藻中检测到了乙酰胆碱结合位点。通过药理学方法也获得了植物细胞中叶绿体[11]和液泡膜[12]上乙酰胆碱结合位点存在的证据。玉米AChE的纯化与其基因克隆是与乙酰胆碱介导系统有关的植物基因和蛋白的第一个直接证据[13]。玉米AChE的88-kDa同源二聚体以二硫键和非共价键方式结合。其前体蛋白为能够实现分泌途径由29个氨基酸残基组成的信号序列。玉米AChE 41到373残基处的保守脂肪酶GDSL家族区域，为其蛋白质结构域。玉米AChEs的初级结构与动物AChEs同源性极低，与高粱AChEs的一致性最高(92%)，其次是水稻和大麦AChEs，相似性分别为77%、64%。相比而言，玉米AChE和双子叶植物AChEs的氨基酸序列一致性较低，为53ndash;58%。推测单、双子叶植物中AChEs不同的初级结构会导致分子结构和酶学性质的不同。后来人们纯化了豆科植物色拉豆的AChE并克隆了它的AChE基因。色拉豆AChE为一个二硫键连接的125kDa同源三聚体，包含了3个41ndash;42 kDa的亚基，对玉米AChE二聚体和色拉豆AChE三聚体及电鳗AChE酶学性质的比较发现，这两种植物AChEs水解硫代乙酰胆碱（或乙酰胆碱）和硫代丙酰胆碱（或丙酰胆碱）但不能水解碳化丁酰胆碱（或丁酰胆碱）,对乙酰胆碱的特异性稳定。对作用底物的分解率较小。植物AChE如玉米AChE和色拉豆AChE也会呈现动物AChE、BChE的酶学特性。 .. 1.2植物启动子 启动子（promoter）是可以被RNA聚合酶辨认并开始转录的脱氧核糖核酸（DNA）序列。来自动物、植物、病毒及微生物的许多启动子都适用于植物。根据启动子功能特点、转录方式分为3类：组成型启动子、诱导型启动子和组织特异型启动子。特定的物理或化学信号的刺激使植物体内的一些基因在诱导型启动子的起始下转录水平显著增加。迄今已分离鉴定了多种诱导型启动子如光、热、创伤诱导型启动子等。通常，这类启动子顺式作用元件比较保守。诱导型启动子可用于验证新基因的功能，诱导型启动子与抗逆基因融合能够提高转基因植物对逆境的适应性。组织（器官）特异启动子调控的基因仅在某些特定的器官或组织部位表达，并表现出发育调节的特性。根据基因表达器官的不同可将其分为种子特异性启动子、果实特异性启动子等。人们需求量较多的蛋白基因可通过其作用大量表达，进而满足人们需求。对组织特异性启动子的深入研究不仅有助于补充植物形态、发育和代谢途径等方面的理论知识，而且有益于基因转录调控的表达模式及其调控机制的发现、提高基因工程中外源目的基因的表达。 . 第 2 章 pCBM-17.5c-AChE 植物表达载体的构建及对大豆的遗传转化 2.1 引言 大豆（Glycine max）是多种蛋白质和食用植物油的主要。在食品生产和工业应用上占据重要的地位。近年来，温室效应日益加剧，全球温度随之升高，当温度超过植物的耐受范围时产生热胁迫影响作物的产量和品质。据文献报道AChE 基因是植物抗高温的积极调控因子[17]。本实验室克隆了玉米（Zea mays）AChE基因并构建了植物表达载体，且用大豆热激启动子 Gm17.5c 替换了 CaMV35S 组成型启动子。通过农杆菌侵染大豆的子叶节外植体将 AChE 基因导入到大豆基因组中，以期获得耐高温的转基因大豆新种质。 2.2 材料和方法 基因克隆及载体构建所用实验药品：ExTaqDNA polymerase、rTaqDNApolymerase 、dNTP、植物RNA提取试剂盒订购于北京天为时代公司。cDNA合成试剂盒、柱式DNA胶回收试剂盒、琼脂糖、限制性内切酶BamH I、 Hind III、XbaI、PstI、IPTG、X-gal、KOD(Blunting high)、T4-DNA连接酶、DIG High Prime DNALabeling、r