山羊痘病毒贵州株的分离与鉴定.pdfVIP

《黑龙江畜牧兽医)2008年第3期 59 山羊蠢扁毒寞蜘豫的分囊与鉴是 程振涛 ，岳 筠 ，徐春志 ，李永明 ，许乐仁 ，文 明 ，周碧君 (1．贵州大学动物科学学院，贵州贵阳550025；2．贵州大学动物疫病研究所，贵州贵阳550025) 中图分类号：$858．27 文献标识码：B 文章编号：1004—7034(2008)03—0059—03 山羊痘是由羊痘病毒属山羊痘病毒(GPV)引起 取待检材料通过鸡胚绒毛尿囊膜接种9～10日 的一种严重危害山羊的高度接触性传染病。试验通 龄鸡胚 (0．2 mL／胚 )，置孵化箱孵育，每日观察 过病原分离、琼脂扩散试验、鸡胚接种、电镜形态学观 2次，7 d后观察胚体病变和绒毛尿囊膜痘斑出现情 察及PCR鉴定等方法对贵州地区山羊群爆发的疑似 况，并取正常鸡胚传至第2代。同时用标准山羊痘阳 山羊痘进行病原的分离与鉴定，现报道如下。 性血清做中和试验，另设PBS对照。 1 材料与方法 1．5 电镜形态学观察 1．1 试验材料与试剂 取患羊皮肤痘疹组织、病变细胞和出现痘斑的鸡 疑似山羊痘病羊的皮肤痘疹组织，采自贵州某两 胚绒毛尿囊膜，用3％戊二醛一1％锇酸双重固定，按 个疫区；山羊痘病毒疫苗弱毒株(Y株)，购自新疆天 常规方法超薄切片，磷钨酸染色。透射电镜观察。 康畜牧生物技术股份有限公司；标准株(B株)、山羊 1．6 PCR鉴定 痘阳性血清，购自中国兽医药品监察所；鸡胚，购自贵 1．6．1 PCR引物的设计与合成 参考GenBank公 州大学科研鸡场；Vero细胞，引自贵州省疾病控制中 布的基因序列和相关文献设计了1对针对山羊痘病 心；细胞培养试剂，购自华美生物工程公司；PCR试 毒P32基因的特异引物，引物序列为P1：5 一 剂，购自北京天根试剂公司。 GCAGATATCCCATYATATGTYATAC 一 3 ．P2：5 一 1．2 病料处理 AACTATATAGGTA从TAACATACCT倪 一3 ，预期扩 取病羊皮肤痘疹组织，以1：5的磷酸盐缓冲液 增片段长度为963 bp。引物由上海生工生物工程技 (PBS)加石英砂研磨成匀浆，反复冻融3次，超声波 术服务有限公司合成。 裂解处理5 nfin，4℃、5 000 r／rain离心15 min．取上 1．6．2 病毒DNA的提取和PCR反应 采用SDS一 清液加入双抗置于4℃冰箱作用6 h，无菌检验合格 蛋白酶K法抽提病毒DNA。PCR反应体系：10×Taq 后一20℃保存，备用。 Reaction Buffer(含MgCl2)5 ，dNTP(10 mmol／L) 1．3 山羊痘病毒的分离与琼脂扩散试验(AGP) 1 IxL，Taq DNA聚合酶(2．5 U／pLL)1 L，上游、下游 用含10％犊牛血清的RPMI一1640作生长液，待 引物 Pl／P2(10 pmol／p,L)各 2．5 p,L，DNA模板 Vero细胞长成单层后，取上述处理后的病料与维持 l ，灭菌双蒸水37 ；反应条件：95℃预变性 液按1：10的比例混合后接种Vero单层细胞，每日 5 min；94℃变性1 rain，55℃退火1 rain，72℃延伸 观察细胞病变，并进行传代。 l min，34个循环；72℃延伸 10 rain。PCR产物于 待细胞出现75％病变时，倒掉培养液，刮取细胞