犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建.pdfVIP

动物医学进展。2OO8，29(2)：24—27 Progress in Vet erinary Medicine 犬新孢子虫NcSRS2基因原核表达质粒的构建 丁 德，梁晚枫，田 野，田万年，贾立军，张守发 (延边大学农学院动物医学系．吉林龙井 133400) 摘 要：根据已发表的犬新孢子虫NcSRS2基因序列，设计1对含有EcoR I和Not I酶切位点的引物。 以提取犬新孢子虫虫体基因组 DNA为模板，应用PCR扩增获得 NcSRS2 ORF基因片段，将此基因片段克 隆到pMD18一T Simple载体上，用EcoR I和Not I双酶切该片段，回收得到含有两个酶切位点黏端的Nc— SRS2 ORF基因，将此基因片段克隆至相同酶切回收后的PGEM一4T一2原核表达载体中，获得重组质粒 pGEX—NcSRS2。经PCR鉴定，限制性内切酶分析和克隆片段序列测定比较，证实了重组质粒的正确性。 关键词：犬新孢子虫；聚合酶链反应；NcSRS2基因；原核表达载体PGEM一4T一2 中图分类号：$858．292；$852．723 文献标识码：A 文章编号：1007—5038(2008)02—0024—04 新孢子虫病(Neosporosis)是由犬新孢子虫 制性内切酶切点(下划线部分)。上游引物为5-AC— (Neospora caninum)寄生于宿主所引起的一种原 GAATTCCCAAACTCAGTGCGTCTC一3 ，下游引 虫病 ]。感染新孢子虫的动物临床症状主要表现为 物为 5，-ACGCGGCCGCCGAAGGCAACTCGTCA一 母畜流产、死胎或新生幼畜运动障碍和神经系统等 3 。 疾病【 ，该病给畜牧业生产造成了巨大的经济损 1．1．3 主要试剂 限制性内切酶EcoR I、Not I、 失 。新孢子虫是一种专性的细胞内寄生虫，国外 ExTaq酶、pMD18一T Simple载体、Agarose Gel 学者在新孢子虫的致密颗粒棒状体里及速殖子表面 DNA Extraction Kit、DNA Marker均为宝生物工程 发现了新孢子虫表面蛋白NcSRS2 j。NcSRS2表 (大连)有限公司产品，表达载体pGEX一4T一2购自 面蛋白介导其黏附及入侵宿主细胞，可以作为酶联 Amersham Pharmacia公司，由延边大学农学院动物 免疫吸附试验有效的抗原成分，是最有希望的新孢 医学系微生物实验室保存。 子虫疫苗的侯选抗原 ]。本研究利用原核表达载体 1．2 方法 pGEX一4T一2，构建犬新孢子虫 NcSRS2基因原核表 1．2．1 NcSRS2基因PCR扩增 以抽提的新孢子 达质粒，目的在于将体外表达的蛋白作为诊断抗原 虫基 因组 DNA 为模板，依次加入去离子水 或免疫原，为进一步建立特异性新孢子虫ELISA诊 17．25／,L，10×PCR缓冲液2．5址L，2．5 mmol／L 断试剂盒、研制新孢子虫 NcSRS2基因疫苗奠定基 dNTPs 2．0／,L，上、下游引物各 1．0／,L，模板DNA 础。 1 L，Taq DNA聚合酶(5 U／uL)0．25 L。反应 1 材料与方法 条件为：94℃5 min；94℃30 S，62℃2 min，72℃ 1．1 材料 1 min，进行 30个循环；最后于72℃ 10 min。PCR 1．1．1 新孢子虫NC一1虫株及菌株 新孢子虫NC一 产物经10 g／L琼脂糖凝胶电泳鉴定。用DNA胶回 1株由日本北海道带广畜产大学原虫病研究所中心 收试剂盒回收PCR产物，回收后取 1 L电泳，纯化 惠赠，本课题前期工作中由细胞培养传代进行增殖， 的PCR产物于一20℃储存备用。 液氮保存，大肠埃希菌BL2l为延边大学农学院动 1．2．2 目的基因与克隆载体的连接、转化及鉴定