基于慢病毒的输卵管特异表达人溶菌酶转基因鸡制备.docVIP

　　基于慢病毒的输卵管特异表达人溶菌酶转基因鸡制备 第一章文献综述 1.1转基因鸡研究进展 转基因小鼠的成功获得突显出了转基因技术在基因功能研究方面的重要价值。自从首次成功获得转基因小鼠以来，一些研究者一直在致力于转基因鸡制备方法的开发。许多研究者都在尝试改进转基因小鼠制备方法，并把它们应用到鸡上。最容易想到的制备转基因鸡的途径就是重复已经在小鼠及几种哺乳动物中取得成功的方法，即受精卵的原核注射。尽管这种方法不允许像基因打勒那样的更为精细的基因修饰，但已经成功地应用在很多转基因研究中。然而，因为鸡的卵母细胞和新生受精卵是比较难以获得及操作的(Etches and Gibbins, 1992)，这种在小鼠上应用起来很简单的方法，在鸡上却不是那么容易。一只蛋鸡一天排卵一次，然后卵母细胞（卵黄）立即进入到输卵管中，在上次排卵后大约15 min即可受精。而后这个蛋要经过大约24 h后由输卵管排出，期间首先在卵黄外包被蛋白，然后在子宫或者壳腺合成蛋壳膜和蛋壳（图1-1)。鸡胚在这个阶段发育迅速，到产出时己经发育到胚盘期。新生受精卵可以在上次排卵后2-3 h从蛋鸡的输卵管中获得。也就是说，一个新生的鸡蛋，包含的不是一个受精卵细胞，而是一个胚盘。1988年，Perry等首次用替代壳法把鸡胚从单细胞阶段培养至出雏（Perry, 1988)。Perry采用的是鸡胚三期培养法，第一期：受精蛋在体外培养24 h至胚盘形成；第二期：鸡胚被转移到一个小的替代壳里培养至第三天；第三期：鸡胚被转移到一个较大的替代壳里培养至出雏。Peny的替代壳三期培养法的鸡胚孵化率为5-10%这种方法的产生促进了通过显微注射载体至鸡受精卵，再体外培养受精卵至孵化的转基因鸡制备方法的发展。 . 1.2慢病毒载体研究进展 慢病毒作为一种逆转录病毒相比其他的病毒载体具有优势，慢病毒能够稳定的整合到宿主基因组，整合效率比普通随机整合高出108-12倍，另外，慢病毒可以侵染分裂期细胞，也可以侵染非分裂期的细胞，因此近年来广泛地被应用于生物学研究之中。病毒，Lentivirus，因Lenti-在拉丁文中有慢的意思而得名。慢病毒是人类和许多动物的病原体，具有较长的潜伏期和持续的感染能力，其潜伏期可长达数月乃至数年。因此，从感染慢病毒到病毒发作是个比较缓慢的过程（Campbell and Robinson, 1998)，慢病毒被归类为逆转录科中的慢病毒属，慢病毒属又包含牛免疫缺陷病毒（Bovine immunodeficioicy virus)、山羊关节炎脑炎病毒(Caprine arthritis encephalitis virus)gt; 马传染性贫血病毒（Equine infectious anemia virus)、猫免疫缺陷病毒（Feline immunodeficiency virus)、人类免疫缺陷 1 型病毒（Human immunodeficiency virus 1)、人类免疫缺陷2型病毒（Human immunodeficiency virus 2)、美洲狮慢病毒（Puma lentivirus)、猴免疫缺陷病毒（Simian immunodeficiency virus)和维斯纳病毒（Visna/maedi virus)等九个种（刘巍峰和高东，1999),国际上关于慢病毒的详细分类见图1-5。 . 第二章材料与方法 2.1实验材料 2.1.1菌株和质粒 大肠杆菌DH5a:为本实验室保存菌种； 大肠杆菌TOP 10:购自康为世纪生物科技有限公司； PMD19-T质粒：购自宝生物公司； pGEM-T Easy 质粒：购自 Promega 公司； pBudcE4.1-GFP质粒：为本实验室保存质粒； pD2.G 质粒：购自 Addgene 公司。 2.1.2细胞系 293T(人胚肾293T细胞)：购自协和医科大学细胞库； 293FT (快速型人胚肾293T细胞)：购自Invitrogen公司； HT1080 (人成纤维肉瘤细胞)：由北京毅新兴业生物技术有限公司惠赠； BHK (叙利亚仓鼠肾细胞)：为本实验室保存细胞系； DF-1 (鸡胚胎成纤维细胞)：为本实验室保存细胞系。 2.2实验方法 2.2.1感受态细胞的制备 1)挑取DH5a大肠杆菌原种，在无抗生素的LB平板上划线，过夜培养； 2)挑取单菌落至含有5mL LB液体培养基的15 mL玻璃试管中，37deg;C, 200 rpm过夜摇菌； 3)第二天早上，按照500mL菌液接到50 mL LB液体培养基的比例进行二次接菌，37deg;C, 200 rpm摇菌2-3 h； 4)在超净台中，将菌液转移到另一无菌、预冷的50mL离心管中，冰上放置10 min； 5)4deg;C, 4,000x贫离心10 min收集菌体