基因重组血管生长抑制剂Kringle5与小分子物质相互作用研究.docVIP

　　基因重组血管生长抑制剂Kringle5与小分子物质相互作用研究 第一章引言 1.1研究背景 Judah Folkman曾在1971年首次提出血管新生的概念并提出肿瘤生长的血管形成依赖性理论，其观点认为肿瘤一旦发生，癌细胞病灶的转移以及肿瘤细胞的增加需要肿瘤组织内有大量毛细血管的形成。在肿瘤细胞病灶增长的过程中，肿瘤细胞可产生血管生长因子来使血管内皮细胞分裂速度加快进而导致血管加速增生，使更多的营养成分通过新生血管供给至病灶[1，2]。由此，Folkman首次提出了通过阻止血管生成刺激物的产生来阻止瘤体增长及抑制肿瘤细胞转移的治疗策略，而经过长时间的探索研究，该观点已经被科研工广泛接受并认可。同时研究也表明，除了肿瘤疾病外，血管新生同时也是包括糖尿病性肾病、糖尿病性眼病等多项血管增生性疾病在内的疾病发病基础[3，4]。所以，如何抑制血管新生是一个全球热点问题，具有非常重要的临床价值，而抗血管生成药物的研究与开发则成为了血管新生性疾病治疗的研究热点。到目前为止，研究者已经在实验室研究合成或从天然组织中提取分离了多种血管生长抑制剂。但在众多具有生物活性的血管生长抑制剂中，除了血管生成抑制素(Angiostatin)、内皮细胞抑制素(Endostatin)以及小牛软骨的血管生长抑制剂外，其他的血管生长抑制剂如AGM-1470、TNP-470、VEGF单抗以及血管内皮细胞生长抑制剂等均具有作用的非特异性，也就是说，很多药物在抑制血管内皮细胞增值的同时抑制了正常细胞的生长并产生了毒副作用，这一现象很大程度的妨碍了血管新生性疾病的进一步临床应用。Angiostatin是O#39;Reilly于1994年发现的。 .. 1.2主要研究内容 蛋白质分子的展开-折叠过程是一个涉及到生命起源和生命过程的问题，同时也是人们一直试图探明的生命科学领域的根本问题之一。目前，人们对于蛋白质转录以及翻译过程的研究较为深入，但是对蛋白质分子在经过翻译后的折叠过程仍无法做出清晰明确的说明；同时，多种严重危害人类健康的疾病譬如说牛脑海绵状病(BSE)，阿尔兹海默症(Alzheimer#39;s)，帕金森氏症(Parkinson#39;s)等等均是由体内某些生理活动中的重要蛋白质分子错误折叠所引起的，这些疾病又被称为折叠病；另外，伴随着基因工程、生物工程的发展，近几十年来，人类已利用基因重组技术得到了大量蛋白药物，如胰岛素、白细胞介素等。但目前利用重组细菌表达所得到目标蛋白大多是以没有活性的包涵体形式出现的，为了得到有生物活性的蛋白分子，就必须对包涵体进行包括展开-折叠过程在内的复杂处理过程[21];最后，蛋白质在体内折叠至天然结构是一个自发的过程，但在实验室中，利用蛋白质合成或者基因工程的方法使得蛋白质分子按照人类意愿折叠为特定构象的目标仍无法实现。所以综上所述，研究蛋白质的展幵-折叠过程就显得尤为重要，而由变性剂诱导的蛋白质的展开-折叠过程，是了解和获取蛋白质分子展开-折叠过程的最佳模型。蛋白质发挥自身生物学功能的前提是拥有特定的蛋白质结构。蛋白质是由20种不同氛基酸经由肽链连接而成的，其中不同的氨基酸顺序称之为一级结构。蛋白质的二级结构是通过分子中氣基酸恒定基团之间的氢键形成的，其中包括无规卷曲、a-螺旋、P-转角以及P-折叠等。二级结构元件会接着折叠成为一个紧密的折叠状态，由极性和非极性基团都参与的弱相互作用所稳定，这种紧密的折叠态被称为蛋白质的三级结构。有的蛋白质中存在多条肽链，这些肽链中的多个亚基会通过疏水力等作用力结合形成四级结构域。 第二章变性剂诱导的血管生长抑制剂Kringle 5的去折叠和重折叠过程 2.1引言 伴随着Kringle 5研究需求量的逐渐增大。从生物组织内提取分离Kringle 5的生产效率已远落后于人们对其的需求，因此，目前包括我们在内的很多实验室都是利用基因工程的方法来获得连续而又稳定的Kringle 5蛋白。利用基因重组的方法获取重组蛋白大多使用大肠杆菌作为宿主菌，但在使用大肠杆菌来表达重组蛋白时经常难以避免的问题就是这些高表达的活性蛋白质经常会以包涵体形式存在。为得到有活性的Kringle 5蛋白，就必须对所形成的的包涵体进行溶解变性以及重折叠复性的处理；另外，功能蛋白与其配体的结合过程伴随着二者之间结构的变化与适应，相比而言，变性剂诱导的功能蛋白的结构变化过程是较为剧烈的，通过研究变性剂诱导的Kringle 5的结构变化也可以使我们对Kringle 5与小分子配体相互作用过程中的结构变化有一个直接而又感性的认识。所以，在本部分实验中，我们主要使用了内源焚光分析法、相图分析法、焚光粹灭分析法以及探针分析法等多手段对变性剂诱导的Kringle 5蛋白的展开-重折叠过程进行了研究，动态地表征了变性剂诱导的Kringle 5蛋