蛋白质的SDS-PAGE分离及转膜.PDF

蛋白质的SDS分离及转膜 复旦大学基础医学院医学实验教学中心 王松梅 021 smwang2@fudan.edu.cn •1 一、实验目的 1. 掌握SDS分离蛋白质的原理和技术 2. 掌握半干转移的操作和Western Blot 的原理和技术 •2 二、实验原理 1. SDS电泳(不连续系统) 2. 转膜(半干转移法) •3 1.SDS分离蛋白质 SDS的作用: ①裂解细胞膜、解离蛋白质之间的氢键、 取消蛋 白分子内的疏水作用、去多肽折叠 ②蛋白质-SDS复合物（1g : 1.4g）,长椭圆棒形 掩盖了蛋白质原有电荷差别 迁移率是分子量的函数 •4 1.SDS分离蛋白质 不连续体系由电泳缓冲液，浓缩胶，分离胶组成 1）浓缩胶为大孔径胶，凝胶缓冲液PH6.7的Tris-HCI 2 ）分离胶为小孔径胶，凝胶缓冲液PH8.9的Tris-HCI 3）电泳缓冲液PH8.3的Tris-甘氨酸缓冲液 •5 NH CH COO- 2 2 SDS-蛋白复合物 浓缩胶(浓缩效应) Cl- SDS-蛋白复合物 NH CH COO- 2 2 分离胶(分子筛效应) Cl- •6 2.转膜(半干转移) • 蛋白质带负电，电场中会往正极移动 • PVDF膜在凝胶和正极之间，将蛋白质拦截在膜上 • PVDF膜可以牢固吸附蛋白质，使蛋白质保留在膜上 •7 • 转膜 半干转移“三明治” 电流方向 •8 三、电泳槽 垂直电泳槽 •9 •10 半干转移电泳槽 •11 四、实验内容 •上样电泳 •染色 •转膜(转膜缓冲液临用前加入15ml甲醇混匀) •封闭 •余下步骤在下周Western blot （三）完成 •12 制胶装置