慢性乙肝免疫基因诊治质粒实验概述.docVIP

　　慢性乙肝免疫基因诊治质粒实验概述 第一章 文献综述 1 乙型肝炎及其治疗现状 慢性乙型肝炎是一种由乙型肝炎病毒（hepatitis B virus）引起的严重传染疾病。全球目前有 20 亿人感染过乙肝病毒，其中约 4 亿人为乙肝病毒慢性感染者， HBV 的持续感染会导致其中部分患者恶化为肝硬化甚至肝细胞癌[1]，每年死于 HBV 引起的肝脏相关疾病的人数达到一百万人。我国是乙肝大国，乙型肝炎病毒的携带率和乙肝发病率居高不下。目前，抗病毒治疗是最有效的乙型肝炎治疗手段，常用的乙肝抗病毒治疗药物有干扰素和核苷类似物等。核苷类似物（拉米夫定、阿德福韦、恩替卡韦等）可通过抑制 DNA逆转录酶活性而抑制乙肝病毒的复制[2,3,4]，尽管现有乙肝抗病毒治疗药物能够有效降低患者血清中病毒 DNA 拷贝数，甚至达到检测不到的程度，但是抗病毒药物不能抑制抗药病毒的产生。这些抗病毒药物很少能够通过有效消除受感染肝细胞中的残余病毒达到对 HBV感染的长期免疫控制的目的，很难实现乙肝表面抗原（HBsAg）和 HBeAg 的血清转阴或完全清除。长期使用抗病毒药物易发生耐药，停药后易出现反弹。干扰素(interferon,IFN）具有直接抗病毒作用和免疫调节作用，可有效提高机体免疫力[5]，但只能注射给药，持续应答率低，副作用多且治疗费用高昂。探寻有效的新型治疗方案成为治疗慢性乙肝的当务之急。 . 2 基因治疗简介 基因治疗（gene therapy）是一种通过向患者靶细胞导入正常基因或者治疗性的基因片段以替代患者体内致病基因的可改变人体内遗传物质的新型治疗手段[6]。第一例基因治疗严重复合型免疫缺陷症患者的临床试验标志着基因治疗已进入迅速发展时代[7,8]。作为一种结合了基因重组技术、靶向免疫治疗等多种技术的生物治疗方法，基因治疗逐渐被人们应用于治疗严重威胁人类健康的多种疾病，包括乙型肝炎、恶性肿瘤、单基因遗传病、心脑血管疾病和艾滋病等[9-11]。抗乙肝病毒免疫基因治疗将外源性的抗病毒因子导入靶细胞内[12,13]，在不同水平上通过细胞因子基因和共刺激分子基因的表达抑制病毒的复制，诱导机体产生免疫应答，同时避免由于长期给药而引发耐药性和副作用。作为一种能有效避免引发耐药性和副作用的全新治疗手段，基因治疗的应用前景显得尤为广阔。基因治疗导入机体的途径有两种，一种是体外基因治疗（ex vivo）途径，即取出患者体内将要导入目的基因的靶细胞，在体外培养后将治疗基因转入靶细胞，再将携带有外源基因的靶细胞回输到人体内，通过靶细胞内基因表达产物达到对机体进行免疫治疗的目的。另一种是体内基因治疗（in vivo），即将承载有治疗性基因片段的载体直接导入机体靶细胞，使其在体内获得表达。 .. 第二章 靶向干扰素和白细胞介素-12的融合表达质粒pVAX-HBVE的构建与表达 1 材料与仪器 1.1 质粒、菌株与细胞株 质粒 pVAX1-IRES-hIL-12 和质粒 pEE14.1-dsFvalpha; 为本实验室前期构建并保存。E.coli.trans5alpha; 感受态购自全式金公司；HEK293T 细胞购自北京市协和细胞库。雌性转基因小鼠（6-8 周龄，转入 1.3 拷贝的 HBV 全基因组），体重 20 g 左右，购自广州空军总医院。 1.2 酶和试剂 三种 DNA 限制性内切酶均购自 Nep PCR System2400 PCR 扩增仪购自 PE 公司；BCD-256KDC 型冰箱购自海尔公司；EPC3000 型恒流恒压电泳仪购自北京六一仪器厂；Cold spring Transilluminator 2020D 自动凝胶成像系统购自 Kodak 公司；Model 680 酶标仪购自 BIO-RAD 公司。 . 2 实验方法 酶切产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳分离，切胶回收得到目的片段，参照北京康为世纪有限公司胶回收试剂盒实验步骤回收酶切产物。具体步骤： a. 酶切产物进行 1%琼脂糖凝胶电泳 25 min，切下目的条带所在的胶块(紫外光照下)，按 100 mu;g/300 mu;L 溶胶液比例配制溶胶液 750 mu;L，溶胶(55℃水浴)，溶胶时不断震荡； b. 溶解后的胶液分多次移入吸附柱，离心,12000 rpm 1 min； c. 倒掉回收管中废液，加入 600 mu;L 漂洗液，离心,12000 rpm 1 min，再重复漂洗一次； d. 倒掉回收管中废液，离心,12000 rpm 2min； e. e． 将吸附柱放到一个新的 Ep 管中，在吸附膜的中央悬空滴加 50 mu;L 洗脱液，室温静置 5 min；离心,12000 rpm， 1 min，回收洗脱液，获得 dSFValpha; 全长基因片段。-20℃保存备用。 .. 第三章 可复制型