核酸疫苗载体pVAX-44质粒高拷贝研究.pdfVIP

囝 2008，VoI．25 No．6亿亏与生物Z狸Ch emistry Bioengineering 核酸疫苗载体pVAX一44质粒高拷贝研究 丁 霞，陆 兵，夏 杰，徐殿胜 (华东理工大学生物反应器工程国家重点实验室，上海200237) 摘 要：研究了质粒复制的前体物质、蛋白质合成抑制剂及金属离子对核酸疫苗载体pVAX 44质粒拷贝数的影响。 结果表明，在改良的LB培养基中分别添加谷氨酰胺、甘氨酸、天门冬氨酸和Fe 时，单位菌体质粒含量分别达到5．88 mg·g 、7．15 mg·g_。、5．93 mg·g一 、7．38 mg·g ，同时添加这几种物质时，质粒拷贝数可以得到进一步扩增。均 匀设计实验结果表明，改良的I B培养基中含有1_6 g·1 甘氨酸、1．0 g·L 天门冬氨酸、0．2 g·L 谷氨酰胺、0．4 mmol-L Fe。 时，单位菌体质粒含量可达到9，ll mg·g ，明显高于单独添加这几种物质时的质粒拷贝数。在此基 础上加入0．1 g·L_1链霉素抑制蛋白质合成，单位菌体质粒含量可达到9．53 mg·g～，较对照提高了56．25 关键词：质粒；拷贝数；核酸疫苗；均匀设计实验 中图分类号：Q 789 文献标识码：A 文章编号：l672—5425(2008)06—0056—04 核酸疫苗即DNA疫苗，相对于传统的蛋白质疫 作者在此选择含有质粒 pVAX-44的大肠杆菌 苗具有许多潜在优势，但质粒DNA在靶细胞中的基 DH5a系统，从基质组分出发，运用均匀实验法进行摇 因表达效率低、持续时间短，因而其用量大，这使质粒 瓶实验，考察了碱基合成前体(谷氨酰胺、天门冬氨酸、 DNA作为生物制剂产品面临新的挑战。下游发酵和 甘氨酸)、金属离子和蛋白质合成抑制剂等因素对质粒 纯化工艺中的许多问题成为核酸疫苗推向市场的瓶 拷贝数的影响。 颈 。 l 实验 质粒DNA的生产近年来受到重视，大多数通过 高密度发酵获得高浓度质粒 DNA。对于 DNA疫苗 l-1 材料 工程的大规模生产而言，一方面要求获得较高的菌体 1．1．1 菌株与质粒 密度，另一方面要求有较高的质粒拷贝数。目前对发 E．coli DH5a(海规生物公司)，含 pVAX-44质 酵生产质粒DNA的研究主要集中在培养基设计和培 粒。pVAX一44是在 pVAX一1的基础上插入结核病抗 养条件优化方面，主要包括不同培养基的比较，培养基 原基因而构成的；具有卡那霉素抗性。 中碳源、氮源、C／N比的确定口 以及发酵策略的研 1．1．2 培养基 究 ]。虽然质粒 DNA拷贝数有所扩增，但是由于菌 种子培养基：改良LB培养基(10 g·I 胰蛋白 体密度大，碱裂解时质粒DNA中混有大量蛋白质，为 胨，5 g·L 酵母浸出粉，5 g·L 氯化钠，23．14 g· 后续纯化工艺增加了负担。因此可以通过提高质粒拷 I KH2PO ，164．32 g·I K2 HPO ，pH值 7．2)， 贝数来扩增质粒 DNA，以获得大量高纯度的质粒 硫酸卡那霉素100／tg·mL 。 DNA。而质粒拷贝数不仅与质粒自身的结构及复制 固体培养基：种子培养基配方中加入2 (质量分 特点有关，还与重组菌的培养基及培养条件有关 ]。 数)琼脂粉。