牛呼吸道合胞体病毒RT—PCR检测方法的建立.pdfVIP

动物医学进展 。2008，29(11)：l一4 ProgressinVeterinaryMedicine 牛呼吸道合胞体病毒 RT—PCR检测方法的建立 王 红，朴范泽，侯喜林 (黑龙江八一农垦大学动物科技学院，黑龙江大庆 163319) 摘 要：根据 GenBankTM上发表的牛呼吸道合胞体病毒核衣壳蛋 白N基因序列，设计合成了一对特异 性引物，扩增大小为 596bp的 目的片段 ，通过特异性试验、敏感性试验和重复性试验建立了牛呼吸道合胞体 病毒的RT—PCR检测方法。所建立的牛呼吸道合胞体病毒的RT—PCR方法与牛腺病毒、牛副流感病毒、牛 传染性鼻气管炎病毒、牛无浆体均无交叉反应，该方法的敏感性可达 lTCIDs。。结果表 明，该方法具有快 速、敏感、特异性强和重复性好等特点，可作为牛呼吸道合胞体病毒检测的一种方法。 关键词：牛呼吸道合胞体病毒；反转录一聚合酶链反应；检测 中图分类号 ：$852．653 文献标识码 ：A 文章编号 ：i007—5038(2008)ii-0001—04 牛呼吸道合胞体病是 由牛呼吸道合胞体病毒 病毒 7型 (BAdV一7Fukuroi株)和牛副流感病毒 3 (Bovinerespiratorysyncytialvirus，BRSV)引起 的 型(BPIV一3BN一1株)由日本动物卫生研究所惠赠； 一 种急性、热性传染病。BRSV属于副黏病毒科肺 牛传染性鼻气管炎病毒(IBRVDQ分离株)、牛无浆 病毒属，为单链负股 RNA病毒，是引起牛和其他反 体 (AnaplasmamarginaleHQ株)由黑龙江八一农 刍动物急性呼吸道疾病的主要病毒之一[1]。该病 以 垦大学传染病实验室分离鉴定和保存。非洲绿猴肾 发热、流泪、流鼻液、流涎、呼吸急迫、咳嗽、乳牛泌乳 细胞(Vero细胞)购 自中国科学院上海细胞库。 量显著下降等为主要特征[2]。牛呼吸道合胞体病对 将 BRSVNMK一7标准毒株接种于长成单层的 养牛业危害很大，1‘5月龄～l8月龄牛发病率高达 Vero细胞上 ，当细胞发生明显 的细胞融合病变时收 8O ～10096／，死亡率为 196／～3 ，给养牛业造成很 获病毒液 ，反复冻融 3次，经 4000r／min离心 大的经济损失。在欧盟许多国家该病被列为仅次于 15min，吸 取上 清 作 为病 毒 液 ，测 定 效价后 置 牛病毒性腹泻(BVD)及牛传染性鼻气管炎(IBR)的 一 70℃保存备用 。 三大重要牛病之一 J。 1．2 试剂与主要仪器 近年来，国外学者对 BRSV蛋 白组成和基 因组 TrizolReagent购 自Invitrogen公司，M-MuLV 结构进行了较为深入的研究，研究多集 中在融合蛋 反转 录酶 (200U／~／L)、HPR IRNA 酶抑 制剂 白(fusionprotein，F)、黏 附蛋 白(attachmentpro— (40U／uL)、dNTP (10 mmol／L)、DEPC 水 、 tein，G)和核衣壳蛋 白(nucleoprotein，N)。研究结 BioReadyLATaqDNA 聚合酶 (5U／uL)、dNTP 果表明，N蛋 白基因具有高度保守性，不同BRSV分 (2．5mmol／L)、DNAMarkerDL2000均购 自宝 离株之间的核苷酸和氨基酸的变异率分别为 1．5 生物工程 (大连)有 限公司；PCR仪购于美 国Bio- 和 0．7 [4]，并且在 BRSV感染细胞 中N蛋 白含量 Rad公司。 最高[5]。因此 ，本研究 以BRSV标准株 N 蛋 白基 1．3 引物的设计与合成 因为研究对象，建立 了 BRSV 的 RT-PCR检测方 根据 GenBankTM上发表 的BRSVN 蛋 白基 因 法，希望能用于牛呼吸道合胞体病 的临床诊断。 序列，DNAStar比对所有 BRSVN蛋白基因序列 ， 1 材料与方法