第八章 蛋白质与氨基酸测定.pptVIP

第八章 蛋白质和氨基酸的测定 ;（二）凯氏定氮法 1、实验原理 以硫酸铜为催化剂， 用浓硫酸消化试样， 使有机氮分解为氨， 与硫酸生成硫酸铵。 然后加碱蒸馏使氨逸出， 用硼酸溶液吸收，再用 盐酸标准溶液滴定。根 据盐酸标准滴定溶液的 消耗量计算蛋白质的含量。 ;2、实验步骤 （1）试样的制备与称样（称0.5-5g试样（含氮30-40mg） 放入凯氏烧瓶中） （2）消化 向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.4g、硫酸钾10g、硫酸20mL。将凯氏烧瓶放在电炉上，缓慢加热。待起泡停止，内容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈蓝绿色透明时，继续加热0.5-1h。取下凯氏烧瓶冷却至约40℃，缓慢加人适量水，摇匀，冷却至室温。 ;（3）蒸馏与吸收 将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。 向接收瓶内加入30mL2%硼酸溶液和1滴混合指示剂。将接收瓶置于蒸馏装置的冷凝管下口，使下口浸入硼酸溶液中。取 10±0.05mL稀释定容后的试液，沿小玻璃杯移入反应室。并用少量水冲洗小玻璃杯，一并移入反应室。塞紧棒状玻璃塞，向小玻璃杯内加入约10mL40%氢氧化钠溶液。提起玻璃塞，使氢氧化钠溶液缓慢流入反应室。立即塞紧玻璃塞，并在小玻璃杯中加水，使之密封。通入蒸汽，蒸馏5min。降低接收瓶的位置，使冷凝管管口离开液面，继续蒸馏1min。用少量蒸馏水冲洗冷凝管管口，洗液并入接收瓶内。取下接收瓶。;(4) 滴定 用0.1mol/L盐酸标准滴定溶液滴定收集液至刚刚出现紫红色为终点。 同一试样做两次平行实验，同时做空白实验。 3、结果计算 (V- V0)×0.014×c X(%) =----------------------------×F×100 m×(10/100);方法二 比色法;2、实验步骤 （1）试样的制备与称样（称0.1-0.5g试样放入凯氏烧瓶中） （2）消化、样品制备 向凯氏烧瓶中依次加入硫酸铜0.1g、硫酸钾1g、硫酸5mL。将凯氏烧瓶放在电炉上，缓慢加热。待起泡停止，内容物均匀后，升高温度，保持液面微沸。当溶液呈蓝绿色透明时，继续加热0.5-1h。取下凯氏烧瓶冷却至约40℃，缓慢加人适量水，摇匀，冷却至室温。 将消化好并冷却至室温的消化溶液全部转移到100mL容量瓶中，用蒸馏水定容至刻度，摇匀。 吸取2.00 mL～5.00 mL试样或试剂空白消化液于50 mL或100 mL容量瓶内，加1滴～2滴对硝基苯酚指示剂溶液，摇匀后滴加氢氧化钠溶液中和至黄色，再滴加乙酸溶液至溶液无色，用水稀释至刻度，混匀。 ;(3)标准曲线的绘制： 吸取0.00 mL、0.05 mL、0.10 mL、0.20 mL、0.40 mL、0.60 mL、0.80 mL 和1.00 mL氨氮标准使用溶液（相当于0.00 μg、5.00 μg、10.0 μg、20.0 μg、40.0 μg、60.0 μg、80.0 μg和100.0 μg氮） ，分别置于10 mL比色管中。加4.0 mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm处测量吸光度值，根据标准各点吸光度值绘制标准曲线或计算线性回归方程。 ;(4)试样测定 吸取0.50 mL～2.00 mL（约相当于氮100 μg）试样溶液和同量的试剂空白溶液，分别于10 mL比色管中。加4.0 mL乙酸钠-乙酸缓冲溶液及4.0 mL显色剂，加水稀释至刻度，混匀。置于100 ℃水浴中加热15 min。取出用水冷却至室温后，移入1 cm比色杯内，以零管为参比，于波长400 nm处测量吸光度值，试样吸光度值与标准曲线比较定量或代入线性回归方程求出含量。;四、结果计算 试样中蛋白质的含量按下式计算： X= 式中： X——试样中蛋白质的含量，单位为克每百克（g/100g）； c——试样测定液中氮的含量，单位为微克（μg）； c0——试剂空白测定液中氮的含量，单位为微克（μg）； V1——试样消化液定容体积，单位为毫升（mL）； V2——制备试样溶液的消化液体积，单位为毫升（mL）； V3——试样溶液总体积，单位为毫升（mL）； V4——测定用试样溶液体积，单位为毫升（mL）； m——试样质量，单位为克（g）； ;(三) 快速测定法 为满足生产过程的快速控制分析，减少环境污染、简便操作省时，建立了快速测定方法 如：双缩脲法、紫外分光光度法、水杨酸比色法、染料结合法 1、双缩脲