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Cry2Ab蛋白的原核表达及条件优化 许炼2，潘志针1，刘波1*，朱育菁1，陈清西2，陈峥1，阮传清1 福建省农业科学院农业生物资源研究所，福建 福州 350003； 厦门大学生命科学院，福建，厦门 361005） 摘要 Cry2Ab蛋白是一类具有杀虫效应的δ-内毒素，广泛应用于害虫的防治。本研究以福建省农科院分离的Bt菌株LSZ9408的DNA为模版，PCR扩增得到Cry2Ab全长基因，构建pET30-a(+)-Cry2Ab重组载体，表达Cry2Ab-H蛋白并进行Western Blot验证；对原核表达条件进行优化得到Cry2Ab蛋白最佳表达条件，通过NTA-Ni预装柱纯化得到单一的Cry2Ab-H蛋白，透析去除Cry2Ab-His蛋白中的咪唑；纯化的Cry2Ab-H蛋白经胰蛋白酶切去N端连同H标签的一段寡肽，得到活化的Cry2Ab蛋白。本研究对Cry2Ab蛋白的表达及纯化条件提供了实验支持，为后续研究Cry2Ab蛋白的杀虫机理奠定了基础。 ABSTRACT Cry2Ab toxin, a kind of delta-endotoxin with insecticidal effect, is wildly used in the prevention of lepidopterid and coleoptera pest. In this study, a full-length sequence of Cry2Ab gene is amplied from the plasmid DNA of Bt strain LSZ9408 (separated by Fujian Academy of Agriculture Sciences); The Cry2Ab gene is connected to plasmid pET30-a(+) to form a recombination vector pET30-a(+)-Cry2Ab. Cry2Ab-His protein is produced by induced the expression vector and the expressed protein is verified to be a Cry2Ab protein by Western Blot. We optimize the prokaryotic expression factors to get the optimum expression condition of Cry2Ab-His protein. A single Cry2Ab-His protein is purified by NTA-Ni prepacked column and dialysis is used to dislodge imidazole. To obtain the activated Cry2Ab toxin, trysin is used to remove a period of oligopeptides including N-terminal and His tag from the purified Cry2Ab-His protein . This study provides experimental support for the expression and purification of Cry2Ab toxin and lays a foundation for the follow-up study of its insecticidal mechanism. 前言 苏云金芽胞杆菌（Bacillus thuringiensis，Bt）是目前应用最广泛的微生物杀虫剂，其特征之一是孢子形成的过程中同时产生伴孢晶体（主要成分是有杀虫效应的δ-内毒素δ-内毒素α 螺旋组成，参与细胞膜形成穿孔的全过程[5]，是杀虫蛋白发挥功能的主要区域；DomainⅢ主要识别昆虫中肠受体(Cadherin、APN、ALP)而后DomainⅡ结合被识别的受体[6]，DomainⅡ和DomainⅢ共同决定靶标害虫的类型。目前主要有2种途径解释Cry蛋白的杀虫机理：经典的细胞膜穿孔途径和钙粘蛋白受体介导的细胞信号转导途径[7]，无论哪种途径都涉及Cry蛋白与昆虫中肠受体的相互作用，因此阐明Cry蛋白和中肠受体的相互作用是研究Cry蛋白的杀虫机理的前提。 目前Cry基因的研究主要是通过定点突变（对DomainⅠ-Ⅲ保守位点进行突变）[8,9]，以此研究特定区域的功能；利用高通量的LC-MS发现新的Cry蛋白表面受体[10,11]，研究昆虫抗性产生的机理；通过不同杀虫基因的融合表达[12]、Bt和其他抗生素进行耦