利用激光共聚焦扫描显微镜的绿色荧光蛋白荧光成像-华南师范大学.PDF

第 19 卷　第 10 期 光　 学 　学 　报 V o l. 19, N o. 10 1999 年 10 月 A CTA O PT ICA S IN ICA O ctober, 1999 利用激光共聚焦扫描显微镜 的绿色荧光蛋白荧光成像 1) 2) 1) 2) 1) 邢　达 　周俊初 　于彦华 　史巧娟 　谭石慈 ) 1 , 华南师范大学激光生命科学研究所, 广州 510631 2) , 华中农业大学, 武汉 430074 摘　要　报道了利用基因标记技术将绿色荧光蛋白(GFP) 基因与目标蛋白基因融合, 并利用激光 共焦扫描显微镜通过探测绿色荧光蛋白的荧光来跟踪观测目标蛋白基因的表达。 关键词　激光共聚焦扫描显微镜, 　绿色荧光蛋白, 　根瘤菌。 从分子水平上阐明完整活细胞内进行的各种生命活动过程及其规律是细胞分子生物学研 究的目标。传统的研究方法, 绝大部分均要求固定或破坏细胞。即使是生物大分子的荧光标 记技术, 虽然在一定条件下也能用于研究活细胞内某些特定的分子过程, 但实验操作复杂, 而且仅能满足短时间的观察。本文报道一种新的标记技术: 绿色荧光蛋白基因标记技术[ 1, 2 ]。 它的独特之处在于采用脱氧核糖核酸(DNA ) 重组技术将绿色荧光蛋白基因与目标蛋白基因 连结起来, 形成一个融合基因表达载体。如果目标蛋白基因得到表达, 绿色荧光蛋白基因将 同时得到表达。那么就可以通过探测绿色荧光蛋白的发光来跟踪观测目标蛋白基因的表达及 其时空特性, 而且绿色荧光蛋白荧光的产生无需任何辅助因子或底物, 因此绿色荧光蛋白标 记系统使得人们能够在方便的正常生理条件下对活细胞或活的生物组织内进行的各种过程及 其分子机理直接进行观察和研究。 本文报导以A r+ 激光器为激光光源的M RC 600 型激光共焦扫描显微镜(L CSM ) 系统与 绿色荧光蛋白基因标记技术结合, 通过对绿色荧光蛋白的荧光的三维时空成像, 对根瘤菌的 侵染过程及根瘤形成等植物固氮研究中的重要问题进行的形态学研究。实验中所用激光共焦 扫描显微镜系统的分辨率比传统的显微镜得到了极大的提高, 还可以在不损伤细胞的情况下 通过改变聚焦深度的方法获得不同层面的光学切片图像, 并利用计算机处理获得细胞的三维 立体图像。 实验材料为紫云英。所用绿色荧光蛋白为突变型的M U T GFP , 其激发峰在 395 nm 和 [ 3 ] 490 nm 。利用酶切和基因重组技术 将绿色荧光蛋白基因与根瘤菌蛋白基因融合, 然后用含 绿色荧光蛋白基因的根瘤菌侵染紫云英, 利用激光共焦扫描显微镜系统通过探测绿色荧光蛋 ( ) 白的特征发光 522 nm 来跟踪观测根瘤菌的侵染过程。 　　收稿日期: © 1995-2005 Tsinghua Tongfang Optical Disc Co., Ltd. All rights reserved. 1440 光　　　学　　　学　　　报 19 卷　 实验中将紫云英与根瘤菌共培养