0 前言 X 射线单晶衍射技术是目前最成功的蛋白质.docVIP

　　0 前言 X 射线单晶衍射技术是目前最成功的蛋白质 　　0 前言 　　X 射线单晶衍射技术是目前最成功的蛋白质结构检测方法。PDB 数据库中已有超过6万个蛋白质结构，而其中85%以上的结构是通过这个方法解析得到的。虽然如此，蛋白质结构解析的速度仍然远低于新功能性蛋白质的研究需求速度。近几年，世界范围内有超过1800 个基因组测序工程，其中1500 个正在进行，335 个已经完成测序工作[1]，已经产生了超过320 万非冗余蛋白质序列[2]。因此，必须加快蛋白质结构的解析速度以适应蛋白质序列测序工作的快速发展。 　　目前，生长大的衍射质量的蛋白质晶体仍旧是结构检测的最大障碍[3-5]。成功获得适合衍射的蛋白质晶体分为两个步骤[6]：第一步是筛选结晶条件获得晶体。当前，稀疏矩阵法[7] 　　是应用最广泛的结晶筛选方法，该方法利用大量不同的结晶溶液进行蛋白质结晶来寻找合适的结晶条件。第二步是优化结晶条件获得衍射质量的晶体。 　　蛋白质结晶过程受多种因素影响，如沉淀剂类型、浓度、pH 值、温度等。由于溶液的化学条件复杂，大多数研究着重在pH 值、盐的类型、浓度和添加剂如聚合体或多羟基化合物等条件上。虽然温度一直以来被认为很重要[8]，但是没有受到足够的重视。传统的蛋白质结晶实验是在恒温条件下进行的，应用最广泛的是277K 和293K[9]。事实上很多蛋白质只有在其适合的温度条件下才能结出晶体[10]。 　　温度对蛋白质结晶的影响，从本质上说是由于温度的改变引起蛋白质的溶解度的改变，从而改变过饱和度，继而影响蛋白质的形核和晶体生长过程[11]。Christopher 等人[12]任意选择30 种蛋白质，发现其中86%的蛋白质其溶解度受到温度的明显影响。通常温度变化1K，溶解度变化约10% [13]。另外，在高沉淀剂浓度下，温度对蛋白质溶解度的影响显著减小[14]。 （作文网zine and V8 protease (P6306)[23]在100mM Na Acetate, 100mMNH4S, 20%(MMOPS, 100mM NH4Br, 80%(attei 等人[25]发展了一种控制形核和生长的方法，该方法选择接近过饱和的均匀溶液条件，在部分区域改变温度使其到达过饱和，从而控制形核的位置和数量。通过这种方法控制溶液小区域的温度实现更少晶核的形成，成功生长了高质量的溶菌酶晶体。 （转载自zw.NSEAC.作文网） 　　1.2 寻找最佳温度用于蛋白质结晶 　　每种蛋白质的最佳结晶温度是不同的。在生长蛋白质晶体过程中，需要寻找最佳结晶温度。由于重组云杉卷叶蛾抗冻蛋白[26]的微观不均一性导致这个蛋白很难结晶，Leinala 等[26] 　　通过在不同温度下筛选结晶条件，结果在318K 下获得了衍射质量的晶体。研究发现，在最佳结晶温度下生长蛋白质晶体减少了蛋白质分子本身动态构象的微观不均一性。GrpE 蛋白是DnaK 蛋白的辅酶，是一种促进蛋白质分子正确折叠的分子伴侣[10]。它是从一种最佳生长温度为338-345K 的嗜热菌中分离得到的，这种蛋白质必须在313K 进行热处理才能生长出晶体，如果不进行热处理就没有晶体出现。这是一个典型的温度诱导方法在蛋白质结晶中应用的例子。 　　Bartling 等人[27]研究了温度对去铁铁蛋白结晶的影响。研究发现，在三种镉浓度下，随着温度的增加最终导致了的晶体尺寸线性增加。在312.5K 下生长的去铁铁蛋白晶体最大。 　　在低的镉浓度下，温度的影响更显著。随着镉浓度的增加，去铁铁蛋白的溶解性对温度变得不敏感，这和溶菌酶一样。在高沉淀剂浓度下，蛋白质溶解度不依赖温度，而在较低沉淀剂浓度下，溶解度强烈依赖温度[21]。 　　即使晶体形成后，温度也会引起蛋白质构象的改变[28]。为了抵挡X 射线衍射源的辐射，晶体一般需要保持在低温状态下，低温可以增加晶体的分辨率，但也有可能引起蛋白质构象的改变。Dunlop 等人[28]对此进行了系统的研究：将同一种蛋白质晶体在三个室温和三个低温数据进行了比较。结果显示，虽然低温下可获得高分辨率的结构和更精确更细节的信息，但是它们系统地背离了室温结构，甚至在结构核心部分观察到显著的区别。这种变化在蛋白质表面更常见。这些区别会影响生物学的解释，因为很多重要的生物过程发生在蛋白质表面。 　　因此，虽然在蛋白质结晶中可以获得高质量的低温数据，但是，室温数据仍是需要的，特别是当研究的蛋白质特性对温度的改变很敏感时。 　　2 变温应用于蛋白质结晶的研究 　　变温方法主要用于生长高质量的蛋白质晶体，同时也应用于提高蛋白质结晶筛选的成功率。在提高蛋白质晶体质量方面，通过改变温度控制溶解度的改变，从而优化晶体生长速度，生长高质量的蛋白质晶体。在蛋白质结晶筛选时，通常事先无法确定最佳结