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基因工程实验课教学改革的再探索 　　摘要：本文对近年来基因工程实验课教改进行再探索，设计两种蛋白质的原核表达纯化及活性测定实验，学生从中任选一种，完成各自实验后合作完成最终实验。此改革拓宽了学生的学术视野，锻炼了学生的自学能力和团队合作能力。 　　关键词：基因工程实验课；教学改革；原核表达纯化；活性测定 　　中图分类号：G642.0 文献标志码：A 文章编号：1674-9324（2017）08-0265-02 　　诞生于20世纪70年代初的DNA重组技术是一种获取、整理、破译、编辑和表达生物遗传信息的现代生物技术，它在诸多方面日益显示出极高的实用价值。目前，作为DNA重组技术产业化应用的基因工程，正在驱动着人类社会生活方式的重大变革。在这一技术浪潮的推动下，基因工程已成为生物科学、生物工程和生物技术本科生的专业主干课程之一。与其他生物学专业课相比基因工程稍有不同，其他生物学专业课比较注重理论部分而对实验部分要求不高（如植物生理学、生物化学和分子生物学等），但基因工程却理论与实验并重，因此实验课在本门课程中的地位就更加重要。通过实验课的锻炼，我们不但能帮助学生提高动手能力，还能反过来加深对理论课的理解，这有助于加强学生的实践能力和创新精神。作为一门炙手可热的前沿科学，近年来基因工程的最新进展可谓日新月异眼花缭乱，在此大背景下基因工程本科教学就必须与时俱进，不断革新从而跟上时代发展的脚步。本文在近年来基因工程实验课改革的基础上再次创新，设计了两种蛋白质的原核表达纯化及活性测定实验，通过创新的实验安排使学生在相同的课时中收获更多的知识，得到更多的锻炼。 　　Lon蛋白酶广泛地分布于微生物、动植物和人类中，是一种多结构域的、ATP依赖型的蛋白酶，负责降解细胞内特殊的调节蛋白质、有缺陷的蛋白质和异常蛋白质，与此同时Lon蛋白酶还具有分子伴侣活性。Lon蛋白酶的这种多活性特点为我们的实验设计提供了较大的空间。绿色荧光蛋白（green fluorescent protein GFP）在蓝色波长范围的光线激发下会发出绿色萤光，因此在日常白光照射下GFP即可呈现出绿色。GFP在低PH值条件下变性后会丧失绿色荧光，经Lon蛋白酶分子伴侣活性作用后复性又能够恢复绿色荧光。GFP蛋白的这种可见特性为初学者的实验操作增加了趣味性。本文设计了这两种蛋白质的原核表达纯化实验，并根据它们的特性设计了后续的活性测定实验。 　　一、进一步探索教学改革的目的 　　当前的大多数基因工程实验课教学改革是设计了一个蛋白质的原核表达及纯化实验。这样的设计不仅较为完整地覆盖了基因工程的实验步骤，而且还将原有的分散的支离破碎的实验安排整合为一个有机的整体。整个实验可将载体的酶切、连接、载体构建、原核宿主转化、重组子的鉴定、蛋白质的表达纯化等相关实验有机地整合起来，是一个前后相继紧密衔接的整体。学生在每个实验过程中都必须小心谨慎全身心投入，因为每一个实验的结果都是后一个实验的初始材料，这就好比一个串联电路，一点断开全盘皆输。这就要求同学们必须极其专心，直到全部实验完成，从而使学生产生更加深刻的印象，从而显著地提升了教学质量。但是经过一段时间的教学实践后，我们又发现了一些有待改进的地方。（1）已有的实验改革虽已覆盖基因工程“切、接、转、增、检”的基本实验步骤，但尚未明确涉及目的蛋白的活性检测实验，因此依然存在实验覆盖面不够完整的问题。（2）因为已有的实验改革只设计了一个蛋白质的原核表达纯化，所以无法比较不同蛋白质表达纯化过程中存在的不同问题。这样便限制了学生的学术视野，很可能会误认为不同蛋白质的原核表达及纯化实验鲜有区别。（3）实验中的目的蛋白基本不可见，使初学者感到实验操作单调乏味，进而影响了学习兴趣。本文针对这些问题进行了教学改革，从而进一步提高了教学质量。 　　二、教学改革内容 　　本实验改革设计了Lon蛋白酶和GFP两种蛋白质的原核表达纯化实验，学生经分组后可任意选取一种蛋白质进行表达纯化，然后各自进行Lon蛋白酶的蛋白酶活性测定实验和GFP变性实验。完成各自全部实验后，表达纯化不同蛋白质的实验小组使用各自产物，以合作的方式完成以GFP为底物测定Lon蛋白酶分子伴侣活性的实验。 　　具体实验内容如下：（1）使用限制性核酸内切酶双酶切中间载体上的目的基因片段和表达载体，然后进行胶回收；（2）使用T4 DNA连接酶将目的基因片段连接到表达载体上；（3）感受态制备和转化；（4）重组子筛选；（5）重组蛋白的表达和纯化；（6）测定Lon蛋白酶的蛋白酶活性或进行GFP蛋白失活实验；（7）以GFP蛋白为底物测定Lon蛋白酶的分子伴侣活性； 　　（8）讨论各自实验过程中的心得体会；（9）撰写实验论文。在第8部分讨论环节中，要求学生充分交流不同蛋白质表达纯化过程中遇到