白质与酶工程 第三章 酶的分离纯化.pptVIP

本章 目录 3.6 酶的浓缩、干燥与结晶 浓缩与干燥都是酶与溶剂（通常是水）分离的过程。在酶的分离纯化过程中是一个重要的环节。 离心分离、过滤与膜分离、沉淀分离、层析分离等都能起到浓缩作用。用各种吸水剂，如硅胶、聚乙二醇、干燥凝胶等吸去水分，也可以达到浓缩效果。 蒸发浓缩是通过加热或者减压方法使溶液中的部分溶剂汽化蒸发，使溶液得以浓缩的过程。由于酶在高温条件下不稳定，容易变性失活，故酶液的浓缩通常采用真空浓缩。即在一定的真空条件下，使酶液在60℃以下进行浓缩。 在固体酶制剂的生产过程中，为了提高酶的稳定性，便于保存、运输和使用，一般都必须进行干燥。常用的干燥方法有： 真空干燥 冷冻干燥 喷雾干燥 气流干燥 吸附干燥 结晶是溶质以晶体形式从溶液中析出的过程。酶的结晶是酶分离纯化的一种手段。它不仅为酶的结构与功能等的研究提供了适宜的样品，而且为较高纯度的酶的获得和应用创造了条件。 酶在结晶之前，酶液必须经过纯化达到一定的纯度。如果酶液纯度太低，不能进行结晶。通常酶的纯度应当在50%以上，方能进行结晶。总的趋势是酶的纯度越高，越容易进行结晶。 要说明的是，不同的酶对结晶时的纯度要求不同。 有些酶在纯度达到50%时就可能结晶，而有些酶在纯度很高的条件下也无法析出结晶。所以酶的结晶并非达到绝对纯化，只是达到相当的纯度而已。 盐析结晶 有机溶剂结晶 透析平衡结晶 等电点结晶 本章 目录 不饱和溶液 饱和溶液 过饱和溶液 析出沉淀（快） 析出结晶（慢） （无排列排队机会） 结晶“三步曲” 第一步：形成过饱和溶液——稍微越过饱和状态，处于介稳 态， 浓缩、降温（少有升温）、调节pH至pI，可使溶 液趋于过饱和。 第二步：形成晶核——过饱和溶液在一定条件下可形成极微小 的有序排列的固相物，成为后续晶体生长的核心，称 为晶核。振荡、搅拌、快速降温可促使过饱和溶液形 成晶核，有时可投入少量“晶种”微粒。 第三步：晶体生长——溶质在晶核周边不断有序排列，晶体逐 步长大。控制条件，如缓慢搅拌、适当升温使细小晶 体溶解，溶质到大晶体周围集结生长。 结晶条件 （1）酶的纯度——一般酶纯度应达到50%以上。 （2）酶蛋白的浓度——对大多数酶来说，蛋白质浓度在 3~50mg/mL 较好。 （3）晶种——有些不易结晶的酶，需加入微量的晶种才能形 成结晶。 （4）温度—— 一般控制在0~4℃范围内。 （5）pH值——一般选择在被结晶酶的pI值附近。 凝胶电泳 1、聚丙烯酰胺凝胶（PAG） PAG由丙烯酰胺（ arc，单体）和甲叉双丙烯酰胺（ bis，双体，交联剂）在催化剂作用下聚合而成。 arc浓度：凝胶的孔径大小 arc和bis的比例：凝胶的强度 催化剂用量：聚合时间 一、聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE） 2、PAGE的应用类型 常规PAGE 浓度梯度PAGE SDS不连续PAGE（用于一般分析分离纯化） 连续PAGE（同上） （用于测定Pr相对分子质量和分离纯化） （用于测定Pr单体相对分子质量和双向电泳） √ √ √ 3、不连续PAGE的特性和分离Pr的效应 （1）三个不连续 凝胶浓度不连续； pH值不连续； 缓冲液不连续。 （2）三种效应 浓缩效应； 电荷效应； 分子筛效应。 4、浓度梯度PAGE 配制4%和30%的分离胶，用梯度混合仪制成从上至下4%~30%的均匀浓度梯度凝胶，其网眼孔径从上至下越来越小，电泳时，不同Pr主要依 r 大小而分离，即分子筛效应电荷效应，可用于测定蛋白质的相对分子质量。 5、SDSSDS：十二烷基硫酸钠 CH3（CH2）11SO4Na2 在配制凝胶时加入SDS，同时加巯基乙醇，Pr在电泳时，其中的寡聚体Pr解聚为单体（亚基），SDS分子就将每个单体分子表面覆盖起来，使其形成短轴为1.8nm，而长轴各异的SDS—亚基复合物，电泳时，他们的表面电荷基本相同，故可因分子长轴大小（即亚基分子大小）差别而分离，换言之，亚基的大小是彼此分离的依据，所以此法可用于测定单体的相对分子质量。 6、PAGE的一般操作程序 配制各种制胶的贮存液 准备制胶模具 配制铸胶混合液 灌注胶液并聚合成凝胶 上槽 点样 通电电泳 取出凝胶 Pr染色 漂洗显带 记录计算 绘制电泳图谱 SDS测定蛋白质（亚基）的相对分子质量（Mr）与它们的电泳迁移率（U）之间，存