福氏痢疾杆菌组氨酸合成中双功能焦磷酸水解酶和磷酸核糖环化水解 .pdf

中国生物工程杂志　ＣｈｉｎａＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，２００９，２９（４）：５６～６０ 福氏痢疾杆菌组氨酸合成中双功能焦磷酸水解酶和 磷酸核糖环化水解酶双功能蛋白的初步研究 １ ２ １ １ １ ２ ２ 陆庆宇 　王其海 　张占钰 　袁道鹏 　高　伟 　仓怀兴 　毕汝昌 （１北京林业大学理学院　北京　１０００８３　２中国科学院生物物理所　北京　１００１０１） 摘要　福志贺氏菌属是一类革兰氏阴性杆菌，是引起人类细菌性痢疾的主要致病源。以福志贺 氏痢疾杆菌２ａ型３０１株全基因组为模板、以ｐＥＴ２２ｂ（＋）为载体、克隆了一个关键基因：组氨酸 合成途径中双功能焦磷酸水解酶和磷酸核糖环化水解酶蛋白（简称：ｓｆ２０８８）。以ＢＬ２１（ＤＥ３）为 表达菌株，优化表达条件，获得了可溶表达的蛋白。经过亲和层析和分子筛层析获得目标蛋白。 采用分析超速离心和动态光散射实验，对纯化后的蛋白进行稳定聚集状态的条件搜索，结果发现 锌离子对稳定其聚合状态很重要。通过正交实验，获得蛋白保持稳定聚集态的条件。这对该酶 的进一步研究奠定了基础。 关键词　组氨酸合成途径　双功能蛋白　ＰＲＡＴＰ焦磷酸水解酶　ＰＲＡＭＰ解环酶　表达与纯化 中图分类号　Ｑ８１９ 　　在氮元素合成代谢通路中，组氨酸生物合成与其 于组氨酸是唯一的一个其碳架结构来自于核苷的氨基 ［１］ 酸［７］。研究此蛋白酶的功能能为研究致病菌痢疾杆菌 前体和中间产物的转化有着很重要的关联 。其合成 通路共有１１步化学反应，８个结构基因参与编码合成 的生理功能提供依据，为将来生物制药提供一定的理 通路中反应所需要的催化酶［１，３，４］。在合成通路中，ＡＴＰ 论基础［８～１０］。 作为底物，先是糖基化，然后是被 ＨｉｓＥ蛋 白： １　材料与方法 ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌＡＴＰｐｙｒｏｐｈｏｓｐｈａｔａｓｅ（ＰＲＡＰＨ）的去焦磷 酸化作用，接着是由 ＨｉｓＩ基因编码的环化水解酶： １．１　材　料 ｐｈｏｓｐｈｏｒｉｂｏｓｙｌＡＭＰｃｙｃｌｏｈｙｄｒｏｌａｓｅ（ＰＲＡＣＨ）的开环反 　　Ｓｆ２０８８基因扩增引物由上海申能博彩公司合成。 应。在这两步关键的转换过程中，ＡＭＰ上的一个氮和 限制性内切酶Ｎｄｅ ／Ｘｈｏ 、ＤＮＡｌｉｇａｔｉｏｎｋｉｔ、ＴａｑＤＮＡ Ⅰ Ⅰ 碳被传递到组氨酸的咪唑环上。具体来说，ＰＲＡＭＰ环 聚合酶，ＤＬ２０００Ｍａｒｋｅｒ，均购自ＴａＫａＲａ生物工程公司。 化水解酶水解ＰＲＡＭＰ上的腺嘌呤环，作用位点在Ｎ１ 质粒提取和胶回收试剂盒均购 自博大泰克公司。 ｐＥＴ２２ｂ质粒、Ｅ．ｃｏｌｉＤＨ５、Ｅ．ｃｏｌｉＢＬ２１（ＤＥ３）菌株由 和Ｃ６之间，这样腺嘌呤继而在腺嘌呤脱氨酶催化下脱 α 下了氨基。这两个酶催化有一共同特征，即都在溶液 本实验室保存。 ［５］ 　　蛋白质晶体生长试剂盒 ＣｒｙｓｔａｌＳｃｒｅｅｎｓＩａｎｄＩＩ和 中存在游离锌离子作亲核攻击实现脱氨作用的 。研 究表明ＰＲＡＭＰ环化水解酶的活性依赖锌离子存在， ＩｎｄｅｘＳｃｒｅｅｎ购自ＨａｍｐｔｏｎＲｅｓｅａｒｃｈ公司。 因此被命名为金属酶［６］。而在有些微生物如痢疾杆菌 １．２　方　法 中，这两步反应可以依靠一个双功能酶 ＨｉｓＩＥ，即同时 １．２．１　ＰＣＲ扩增　根据测定的ｓｆ３０１菌株的全基因组 拥有 ＨｉｓＩ和ＨｉｓＥ两种酶在反应中的作用来实现。由 序列设计引物，序列如下： 　　Ｆ：５′ＧＧＡＡＴＴＣＡＣＴＣＧ