实验三电子光谱法研究二氯邻菲咯啉合铜与dna相互作用研究.docVIP

实验三 电子光谱法研究二氯邻菲咯啉合铜与DNA相互作用研究 一．实验目的 1.1 了解研究金属配合物与DNA相互作用的原理和意义 1.2 掌握研究金属配合物与DNA相互作用的光谱法实验技术 1.3. 掌握相关研究方法的实验数据的处理方法 1.4. 熟悉紫外-可见光谱仪的工作原理及基本操作 二． 实验原理 2.1 DNA是生物体中重要的一类生物大分子,对于生命遗传密码的翻译、转录、复制起着非常重要的作用。为了进一步探索和认识DNA的性质、结构、行为、形态, 揭露生命之奥秘，人们研究了大量金属配合物与DNA 的反应。同时探测DNA 的结构和构象，探讨金属配合物与DNA作用的反应机理, 进而研究金属配合物的分子结构和与DNA反应机理的关系, 也可以为筛选出新的生物学研究工具, 设计合成出具有应用前景的低毒、高效、抗菌、抗肿瘤药物提供一定的科学研究基础及理论根据 2.2小分子与DNA相互作用能改变的结构和性质，改变细胞的代谢方式和生长速度，有时甚至终止细胞生长，因此，与DNA相互作用的小分子可作为DNA的结构探针和化疗试剂。DNA结合试剂主要以两种方式与其靶分子相互作用：(1)结合在的大、小沟中，静电疏水、相互作用及氢键能稳定这种结合方式，如[Cu(phen)2]2+、阳离子金属卟啉及有机抗癌药物等以这种方式和DNA结合；(2)插(嵌)入到DNA的碱基对之间，如EB及抗癌药物顺铂等。无论那一种方式均可能导致DNA结构畸变、解链，甚至断裂。各种光谱方法和分子生物学方法可用于表征小分子与DNA相互作用，如紫外-可见光谱学方法、荧光光谱法测定[Cu(phen)2]2+与DNA的相互作用 2.3紫外-可见吸收光谱法是研究药物与DNA相互作用机理最为常用、方便的方法。DNA的碱基具有光学活性，在260 nm处具有最大吸收峰，同时许多药物小分子也具有光学活性，当它们与DNA结合后，对DNA或药物小分子的吸收谱都会引起变化，如吸收谱带变宽、红移(蓝移)效应和减色(或增色)效应。通过这些变化可以判断两者的作用方式。配合物的MLCT(中心离子与配体之间的电荷跃迁)吸收峰的强度在有DNA存在时有一定减少，这通常被认为是插入作用的特征之一。通过对配合物Q ([Q]=10-5mol/L)与不同浓度DNA混合后的紫外光谱研究可以发现，DNA对配合物特征吸收峰有减色效应(MLCT)。由不同摩尔比的配合物与DNA作用后在190nm～500nm区间内的紫外吸收光谱图可见，配合物与DNA作用后吸收光谱发生减色，吸收峰有轻微的红移，说明配合物与DNA发生了作用，且为插入式键合 配合物与DNA的结合常数Kb可以通过下列方程求出： [DNA] /( εf -εa) = [DNA]/(εf –εb)+ 1/Kb× (εf –εb) （1） 式中[DNA]表示DNA 的浓度, εa, εf, εb 分别代表配合物Q的表观摩尔消光系数Aobsd/[Q]，自由配合物的摩尔吸光系数和完全结合后的配合物的摩尔吸光系数(λ=267nm)。以[DNA]/( εf –εa)对[DNA]作图，斜率与Y轴的截距的比值即为结合常数Kb。结合常数Kb越大，说明配合物Q与DNA的相互作用越强 三、实验仪器与药品 3.1. 仪器 紫外-可见光谱仪、小烧杯、容量瓶、样品袋、10mL比色管1套、冰箱、电子天平 3.2. 试剂 3.2.1 NaCl、Tris、盐酸、小牛胸腺 DNA、二次蒸馏水 3.2.2缓冲溶液：5mmol·L-1 Tris-HCl溶液( 内含50mmol·L-1 NaCl , pH 7.4) ：称取5 mmol（0.6055g）的Tris和50 mmol的NaCl（2.922g）固体溶解于1L水中，再用1 mol·L-1的 盐酸溶液将上述溶液pH调至7.4备用；配合物、DNA均用该缓冲液配制溶液 四．实验步骤 4.1．DNA溶液配制 （1学时） 称取适量的小牛胸腺 DNA 溶于缓冲溶液中，抽滤，滤液按需要稀释至一定浓度，测量260 nm 和280 nm 处吸光值，若A260/A280 = 1.8 ～ 1.9，说明基本上不含蛋白质，不需要进一步处理。DNA 浓度以碱基对的摩尔浓度计，测量DNA在260 nm处的吸光度，然后根据260 nm处的摩尔吸光系数6600 L·mol-1·cm-1 计算DNA 的浓度。测量DNA 吸光度时，如DNA浓度过高，可导致测量不准，一般应稀释到A在0.5 ～ 1.0 之间较为合适。配制好的DNA溶液应置于冰箱中保存备用。 [DNA]=K×A260/6600 (mol·L-1) 其中K为稀释倍数。为了保证实验的可靠性，配制的DNA溶液在一周内使用 4.2．用紫外-可见吸收光谱(UV-vis)测定[Cu(phen)2]C