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人神经营养素-3基因克隆及原核表达【摘要】目的通过基因工程的方法克隆人神经营养素-3成熟蛋白(hNT-3)的基因，并在大肠杆菌中进行表达，为研究hNT-3的生物学作用提供材料。方法以人胎脑cDNA为模板，采用PCR方法扩增hNT-3基因，并将其克隆在pGEM-T载体上，将经过序列分析确定的hNT-3基因插入原核表达载体pGEX-6p-1中，构建了重组表达载体pGEX-6p-1-NT-3，用SDS法测定其在大肠杆菌中的表达。结果经序列测定分析，所克隆DNA片断与文献发表序列(GenBank, MW002527)同源性为99.7%，并获得了高效表达hNT-3蛋白的重组菌株。结论体外成功扩增hNT-3基因，并在原核细胞中高效表达。 【关键词】神经营养素-3；PCR；基因克隆；原核表达 神经营养因子（neurotrophic factor，NTF）是机体产生的能够促进神经细胞存活、生长、分化的一类蛋白质。神经营养素家族（neurotrophin family， NTs）是“经典的”神经营养因子，包括神经生长因子（nerve growth factor，NGF）、脑源性神经营养因子（brain-derived neurotrophic factor，BDNF）、神经营养素-3（neurotrophin-3，NT-3）、神经营养素-4/5（neurotrophin-4/5，NT-4/5）、神经营养素-6（neurotrophin-6，NT-6）和神经营养素-7（neurotrophin-7，NT-7）。 神经营养素-3，分子量为13.6 KD，等电点9.3，人NT-3基因定位于染色体12p13区，编码258个氨基酸残基的前体蛋白，裂解后得到由119个氨基酸残基构成的成熟蛋白，NT-3广泛分布于外周和中枢神经系统内，主要在海马、背根节、脑干、脊髓等。研究表明NT-3功能广泛，可在体或离体调节周围和中枢神经系统神经元形态[1]；维持胚胎发育中神经元存活、促进其分化与增殖[2]；诱导其轴突生长[3]以及调控成熟神经元生理功能[4]和促进损伤神经元修复。 1 材料和方法 1.1材料胎脑组织取自引产胎儿；菌株E. coli JM109、E. coli BL21(DE3) pLysS、质粒pGEX-6p-1由本实验室保存；质粒pGEM-T，M-MLV反转录酶购自Promega公司；Trizol购自MIC公司；LA Taq DNA聚合酶，EcoR I、Sal I，T4DNA连接酶购自TaKaRa公司。 1.2方法 1.2.1引物设计与合成根据Genbank发表的人NT-3序列(MW002527)设计2条引物，上游引物导入EcoR I酶切位点，由上海生工生物技术公司合成。引物序列如下： 上游引物NT3-S（24bp）：5’- GAA TTC TAC GCG GAG CAT AAG AGT -3’， 引入一个EcoRⅠ酶切位点； 下游引物NT3-A（21bp）：5’- TGC CAA TTC ATG TTC TTC CGA -3’。 1.2.2RT-PCR 用Trizol试剂抽提人胎脑总RNA，以oligo dT(18)为引物，反转录合成cDNA第一链作为模板，用NT-3特异引物进行PCR扩增，反应条件为：94℃ 1 min，55℃ 1 min，72℃ 1 min，共35个循环。 1.2.3克隆载体的构建与序列分析用DNA纯化试剂盒回收纯化PCR产物，再将其克隆至pGEM-T载体中，构建克隆载体pGEM-T-NT-3，转化入E. coli JM109感受态细胞，经酶切鉴定阳性重组子后，由上海英骏(invitrogen)生物技术公司测序。 1.2.4原核表达载体的构建：用EcoR I和Sal I自重组克隆载体pGEM-T-NT-3切下NT-3编码序列，电泳回收目的片段并连接至经相应酶处理线性原核表达载体pGEX-6p-1，构建原核表达载体pGEX-6p-1-NT-3，转化入E. coli BL21(DE3) pLysS感受态细胞。经筛选及酶切鉴定， 挑选出阳性重组质粒。 1.2.5融合蛋白在大肠杆菌中的表达挑取阳性重组质粒pGEX-6p-1-NT-3单菌落接种在含氨苄青霉素的LB培养基中，37℃振摇培养过夜，次日以1:50扩配，继续37℃振摇培养至培养液的OD600达0.4~0.6，加入IPTG至终浓度为1.0 mmol/L，诱导培养4 h，收集菌体，重悬于PBS(pH7.4)，超声处理，用SDS分析表达蛋白的相对分子质量，考马斯亮蓝R-250染色。 1.2.6融合蛋白最佳表达条件的确立 1.2.6.1最适诱导时间的选择将阳性重组质粒pGEX-6p-1-NT-3单菌落3