免疫金银染色法检测SLE患者血清ANA及抗-dsDNA抗体.docVIP

免疫金银染色法检测SLE患者血清ANA及抗-dsDNA抗体【摘要】 目的 探讨免疫金银染色法检测抗核抗体(ANA)、抗dsDNA抗体对诊断系统性红斑狼疮(SLE)的价值。方法 采用免疫金银染色法(IGSS)检测SLE患者血清中ANA和抗．dsDNA。结果 活动期ANA、抗．dsDNA阳性率与非活动期比较差异有统计学意义(P0．5 g/d或蛋白尿“+++”以上,②有细胞管型。 1．2．2 正常对照血清 为新乡市中心血站无偿献血员血清,共46份。 1．3 金标记羊抗人IgG 1．3．1 亲合层析提纯羊抗人IgG为华美生物工程公司产品。 1．3．2 胶体金溶液 由本实验室参考全国临床检验操作规程[3]通过鞣酸．枸橼酸钠还原法制备直径为5 nm的胶体金溶液。 A液：1%HAuCl4水溶液1 ml加入79 ml双蒸馏水中混匀。 B液：1%枸橼酸三钠4 ml，1%鞣酸0．7 ml，0．1 mol/L K2CO3液0．2 ml，混合，加入双馏水至20 ml。 将A液、B液分别加热至60℃，在电磁搅拌下迅速将B液加入A液中，溶液变蓝，继续加热搅拌至溶液变成亮红色。此法制得的金颗粒的直径为5 nm。 1．3．3 待标记蛋白溶液的制备 将待标记蛋白羊抗人IgG预先于0．005 mol/L pH7．0 NaCl溶液中4℃透析过夜，以除去多余的盐离子，然后100 000 g4℃离心1 h，去除聚合物。 1．3．4 待标胶体金溶液的准备 以0．1 mol/L K2CO3或0．1 mol/L HCl调胶体溶液的pH值至9．0；由于胶体金溶液可能损坏pH计的电板，因此，在调节pH时，采用精密pH试纸测定为宜。 1．3．5 胶体金与标记蛋白用量之比的确定 ①将胶体金溶液调好pH之后，分装10管，每管1 ml;②将标记蛋白羊抗人IgG以0．005 mol/L pH9．0硼酸盐缓冲液做系列稀释为5~50 μg/ml，分别取1 ml，加入上列金胶体金溶液中，混匀。对照管只加1 ml稀释液;③5 min后，在上述各管中加入0．1 ml 10%NaCl溶液，混匀后静置2 h，观察结果;④结果观察，对照管(未加蛋白质)和加入蛋白质的量不足以稳定胶体金的各管，均呈现出由红变蓝的聚沉现象；而加入蛋白量达到或超过最低稳定量的各管仍保持红色不变。以稳定1 ml胶体金溶液红色不变的最低蛋白质用量，即为该标记蛋白质的最低用量，在实际工作中，可适当增加10%~20%。 1．3．6 胶体金与羊抗人IgG的结合 将胶体金和羊抗人IgG溶液分别以0．1 mol/L K2CO3调pH至9．0，电磁搅拌羊抗人IgG溶液，加入胶体金溶液，继续搅拌10 min，加入一定量的稳定剂以防止抗体蛋白与胶体金聚合发生沉淀。我们加入5%BSA作为稳定剂使溶液终浓度为1%。 1．3．7 胶体金标记蛋白的纯化 采用超速离心法：先低速离心1 800 r/min，20 min，弃去凝聚的沉淀。然后将5 nm胶体金结合物用6 000 g，4℃离心1 h；仔细吸出上清，沉淀物用含1%BSA的PBS液(含0．02%NaN?3)，将沉淀重悬为原体积的1/10，4℃保存。在结合物内加50%三酰甘油可贮存于．70℃保存1年以上。 1．3．8 胶体金蛋白结合物的质量鉴定 胶体金颗粒在波长510~550 nm之间出现最大吸收值峰。用0．02 mol/L pH8．2 PBS液(含1%BSA，0．02%NaN?3)将胶体金蛋白试剂作1?∶?20稀释，OD??520?＝0．26,符合要求。(一般应用液的OD??520?应为0．2~0．4)。 1．4 银染液配制 采用本实验室[4]配方液,A液:0．22%乙酸银溶液。B液:50%阿拉伯树胶,去离子水溶解,每天摇动,5 d后取滤液使用;C液:1%对苯二酚溶液,500 mg对苯二酚溶于30 ml 0．05 mol/L pH3．8柠檬酸盐缓冲液中。D液:在C液中加入10~40 ml B液。银染液:将A液和D液等量混合即成(临用前配)。 1．5 稀释液及洗液 pH7．2,0．01 mol/L PBS．Tween20缓冲液。 1．6 检测流程 稀释 用稀释液稀释血清。 加样：将加样板放在泡沫板上，按顺序分别滴加25 μl稀释后的血清至加样板的反应区中，避免产生气泡。滴加完所有待测标本后才开始温育。 第一次温育：将载片覆有生物薄片(抗原片)的一面朝下，盖在加样板的凹槽里，反应立即开始。确保每一个标本均与生物薄片接触，且标本间互不接触。室温温育30 min。 清洗：用烧杯盛PBS．Tween洗涤液，流水冲洗载片1 s然后立即(不要吹干)将其浸入装有PBS洗涤液的小杯