十味接骨药对家兔骨折骨细胞生长机理实验探究.docVIP

十味接骨药对家兔骨折骨细胞生长机理实验探究【摘要】 目的 研究十味接骨药对家兔骨折骨细胞生长修复过程中骨痂中TGF-β?1,羟脯氨酸、钙、磷;血清中碱性磷酸酶、钙、磷的变化和作用机理。方法 实验用健康日本大白兔81只5~6月龄造成双侧前肢0.7 cm横断性骨缺损,保留尺骨完整,并分成三组,对照组和实验组,空白组不用药,实验组给十味接骨药,对照组给骨折挫伤散。2周、5周、8周分别取材,观察十味接骨药对骨折修复的影响。结果 实验组骨痂中TGF-β?1、HRP先升高后递减;血中骨痂中Ca、P峰值提前出现,血中ALP随骨生长逐渐升高。与对照组相比较统计学?*P 1.6 观察指标与方法 1.6.1 血样分析 三组动物按三个时间段进行P-ALP、S-Ca、S-P分析,将兔放兔盒中固定,选耳后静脉清晰部位拔除局部绒毛,75%乙醇消毒,摩擦静脉使之扩张,用6号针头在耳缘静脉末稍刺破血管,待血渗出后用注射器抽取血液2 ml放不加抗凝剂试管中,用80-Z离心机离心制成血清,用奥林巴斯AU-2700全自动生化分析仪分析血清钙(Ca)、磷(P)、碱性磷酸酶(ALP)。 1.6.2 骨痂分析 羟脯氨酸(HRP)、钙(Ca)、磷(P)。将新鲜骨痂用丙酮脱脂脱水12 h真空干燥称重,用10%三氯乙酸脱钙脱磷,用甲基百香酚蓝比色法测提取液中的钙;用孔雀绿直接显色法测提取液中的磷,剩余骨痂用蒸馏水冲洗,滤纸吸去多余的水分称重,用样本碱水解法测骨痂中的羟脯氨酸。具体做法:①骨痂标本丙酮脱脂脱水,用TH2-88-1型多用恒温台式振荡器振荡3 h后,静置12 h,使脱水完全取出样本置于真空干燥皿中,用SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵真空干燥后,用MettierH54AR十万分之一分析电子天平称重,将干燥样本浸在3 ml,10%三氯乙酸中提取样本中的钙、磷24 h取出样本待用。按试剂盒说明方法测钙、磷;②用甲基百香酚蓝比色法测提取液中的钙(Ca)含量,空白管、标准管,测定管中各加1.0 ml甲基百香酚蓝(MTB)试剂和2.0 ml碱性溶液,空白管加20 μl去离子水,标准管加20 μ、25 mmol/L钙标准液测定管中加20 μl待测提取液,分别混匀静置5 min后,波长610 nm、1 cm光径,蒸馏水调零,HP8452A紫外可见分光光度计测各管吸光度;③用孔雀绿直接显色法测提取液中磷含量,空白管标准管测定管分别加入1 ml尿素溶液2 ml孔雀绿-钼酸液,再空白管中加20 μl去离子水,标准管加20 μl、1.29 mmol/L磷标准应用液,测定管加20 μl待测提取液,分别混匀,室温准确放15 min,640 nm、1 cm光径,蒸馏水调零用HP8452A紫外可见分光光度计测各管吸光度;④从10%三氯乙酸中取出骨痂样本经蒸馏水冲洗后滤纸吸取多余水份,用电子天平称重(取样本湿重)用样本水解法测羟脯氨酸(HRP)含量。精确称取样本湿重(30～100 mg)后放入试管中,准确加入水解液1 ml混匀加盖后放入沸水浴水解20 min(10 min时混匀一次使水解更充分),然后取出,将各试管流水冷却后,各管加指示剂1滴摇匀。各试管准确加入调PH甲液1.0 ml混匀(此时溶液为红色)用200 μl加样器吸取调PH的乙液向各管逐滴小心加入调PH的乙液,每滴加入后摇匀,直至液中试剂颜色变成黄绿色,此时PH值6.0~6.8左右。再加蒸馏水至10 ml混匀,取3~4 ml稀释的水解液加适量活性炭(约20~30 mg),以上清液离心澄清无色为准。3500转/ min离心机离心10 min,经滤纸滤后,取清液1 ml做检测。空白管、标准管、测定管分别加1.0 ml蒸馏水1.0 ml 5 μg/ ml标准应用液1.0 ml待测定,然后各加0.5 ml试剂混匀,静置10 min,加试剂二0.5 ml混匀,60℃水溶15 min,冷却后,3500转/min,离心机离心10 min,取上清液550 nm波长1 cm光径,蒸馏水调零,测各管吸光度读数。 1.6.3 免疫组化实验微波脱钙。用7.15EDTA液适量,方法:将骨组织放入微波专用盒,根据组织的多少放适量的脱钙液在微波下55℃间歇脱钙,以每次辐射2 min为一脱钙循环,经过反复筛选以30个脱钙循环为最佳脱钙终点,在2个循环之间将标本盒出微波炉外,室温冷却5 min,保证每次辐射中脱钙温度,随时更换新液,5 d后骨组织脱钙完毕,以针灸针能穿透骨组织为脱钙终点。脱钙后福尔马林溶液常规固定24 h,常规梯度乙醇脱水75%~100%乙醇,各脱水6 h。二甲苯透明1 h,60℃ 恒温箱浸腊分别1 h、0.5 h。石腊包埋,作3 μm切片裱片,脱腊至水,一部份做HE染色,一部份做S2P(链霉素菌抗生蛋白过氧化物酶)染色