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批量筛检献血者不规则抗体方法【关键词】 献血者;不规则抗体;批量筛检 作者单位:454150 河南省焦作市中心血站 现代输血技术的核心理念是安全和有效输血。近年来,由于血液传染性指标的检测技术不断进步,经输血传染病毒的危险性已大幅度降低。但是,由于人类血型抗原系统的复杂性,由输血引起的输血免疫反应时有发生[1]。保证患者输注免疫学“相容”的血液,预防输血不良反应,已成为广大输血工作者的重要研究课题。我国专家多年前就已经提出,输血前应对受血者和供血者的红细胞不规则抗体进行筛选 [2],以提高临床输血的安全性和有效性。但常规的试管法由于费时繁琐,不可能对大量献血者的不规则抗体进行批量筛检。为此,笔者将96孔U型微板看作是96个“短”试管的联合体,将间接抗人球蛋白试验改良后在微板中进行,使献血者不规则抗体的批量筛检简单易行,和试管法对比效果良好,现报告如下。 1 材料和方法 1.1 试剂 抗人球蛋白试剂(IgG)、抗-D(IgG)、筛选细胞、谱细胞由上海血液生物医药有限责任公司提供;抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗-Fya、抗-JKa由加拿大Dominion Biologicals Limited公司提供;所有试剂均在有效期内使用。指示细胞由笔者在使用当天配制。 1.2 仪器设备 AT全自动样本处理系统(瑞士HAMILTON公司);Labofuge400平板离心机(美国Beckman公司);HH.W21.600型电热恒温水浴箱(北京光明医疗仪器厂);HTⅢ扫描酶标仪(奥地利ANTHOS公司);KA-2200血球洗涤离心机(日本KUBOTA公司);TG-328A光学分析天平(湘仪天平仪器厂); 96孔硬质U形微型板(丹麦Nunc公司)。 1.3 检测样品 1.3.1 19份已知不规则抗体为阳性的献血者和受血者血清(由日常工作中用试管法筛查并已用谱细胞确定了抗体特异性),用该法重新进行抗体筛查。 1.3.2 7份标准抗血清:将抗-D(IgG)、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、抗-Fya、抗-JKa分别倍比稀释后,和试管法平行测定其效价。 1.3.3 分批次随机抽取本站无偿献血者标本2160份(2009年1月～2009年6月,每周三次,每次30份),和试管法平行筛查其不规则抗体,阳性结果用谱细胞确定抗体的特异性。 1.4 醛化、包被筛选红细胞 1.4.1 将筛选红细胞用生理盐水洗涤3次,再用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤1次,用含3.4%葡萄糖的磷酸盐缓冲液配制成1%的红细胞悬液。 1.4.2 用0.05%的戊二醛处理微板,每孔加入100 μl,静置20 min,弃去,生理盐水洗涤1次。 1.4.3 将1%筛选红细胞加入微孔板中,每孔50 μl,300 g离心2 min,使红细胞平铺孔底,静置20 min。 1.4.4 用生理盐水洗涤3遍,每次均轻轻拍干备用。 1.5 抗人球蛋白试剂的稀释 用微板法对比试验,确定抗人球蛋白试剂的最佳稀释度为1?∶?3。 1.6 指示细胞的配制:将3人份O型红细胞混合,用生理盐水洗涤3次,取适量压积红细胞等量加入IgG抗-D血清,37℃孵育30 min,离心去上清,用生理盐水洗涤5次,再用pH7.2的磷酸盐缓冲液洗涤1次,用含3.4%葡萄糖的磷酸盐缓冲液配制成1%的红细胞悬液备用。 1.7 检测 1.7.1 用AT全自动样本处理系统将检测样品加入醛化、包被好筛选红细胞的微板中,每孔100 μl,同时做阳性、阴性对照各2孔,阳性对照加入与筛选细胞含有对应抗体的血清100 μl,阴性对照加入AB型血浆100 μl,37℃孵育30 min。 1.7.2 弃去孔内液体,用生理盐水洗涤5遍,每次均轻轻拍干。 1.7.3 加入稀释好的抗人球蛋白试剂,每孔50 μl。 1.7.4 加入稀释好的指示细胞,每孔50 μl。 1.7.5 1200 g离心2 min,孔内红细胞呈扣状沉淀为阴性,平铺于孔底为阳性。 1.7.6 用酶标仪判读结果 根据孔内指示细胞分布情况,用酶标仪判断结果。 2 结果 2.1 19份抗体阳性标本阳性检出率100%,未出现假阴性。 2.2 7种抗血清效价比较,相差不超过1个滴度,见表1。 2.3 2160份献血者标本,试管法检出5份,阳性检出率0.23%,微板法检出7份,阳性检出率0.32%,经谱细胞确认,具有临床意义的特异性抗体均为5份,分别为1份抗-D、2份抗-E、1份抗-M、1份抗-c,说明微板法有一定的假阳性。 表1 微板法和试管法检测7种抗血清效价比较 DCcEeFyaJKa 微板法64321664464