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正交实验优选水牛角酶解提取工艺探究[摘要] 目的:研究水牛角酶解的最佳提取工艺。方法:以蛋白质含量为指标,通过正交实验筛选水牛角的最佳酶解提取条件。结果:水牛角最佳酶解工艺为:胃蛋白酶,pH=2,加酶量700 U/g,温度39℃,时间4 h。结论:正交实验确定的条件可较好地应用于水牛角的酶解提取。 [关键词] 正交实验;水牛角;酶解;提取工艺 [中图分类号] R965 [文献标识码]A [文章编号]1674-4721(2009)07(b)-024-02 水牛角始载于《名医别录》,为牛科动物水牛BubalusbubalisLinnaeus的角,为临床常用中药,性寒,味苦,具有清热解毒、凉血、定惊的功效,用于温病高热、神昏谵语、发斑发疹、吐血衄血、惊风、癫狂等症[1]。文献资料表明对水牛角的活性物质及药理活性研究较少,原药材直接口服,生物利用度低,我们模拟人体胃肠道环境,采用生物酶仿生提取技术,以正交实验筛选水牛角粉的提取工艺,为进一步研究奠定基础。 1 实验材料 1.1 仪器与设备 电子天平;恒温水浴锅;H198107笔式酸度计;UV-120-02分光光度计;NO1506-017紫外分光光度扫描仪。 1.2 试剂与材料 水牛角粉(成都千方中药饮片有限公司,国药准字;胃蛋白酶(活性1∶4600,济南亚康力诺生物工程有限公司,批号070323);牛血清白蛋白(Roche公司);考马斯亮蓝G250(上海化学试剂站分装厂,批号061005)。 2 实验方法与结果 2.1检测方法的建立 2.1.1 考马斯亮蓝试剂的配制 精密称取考马斯亮蓝G 250 10 mg于100 ml容量瓶中,加5.00 ml乙醇使溶解,再加85%磷酸溶液10 ml,蒸馏水定容至刻度[2]。 2.1.2标准蛋白质溶液的制备 精密称取25 mg牛血清白蛋白置于25 ml的容量瓶中,定容至刻度,配成1 000 μg/ml的标准蛋白质溶液。 2.1.3 样品液的制备 称取水牛角粉1.00 g,加入胃蛋白酶0.55 g,9.00 ml蒸馏水中,浓盐酸调pH=(2.00±0.01),在(37.0±0.1)℃水浴中提取4 h。提取液放入85℃的水浴中灭活15 min后用滤纸过滤,得滤液,稀释10倍,以12 000 r/min离心10 min,取上清液作为样品液[3]。 2.1.4阴性样品液的制备 按照2.1.3项下,无水牛角粉,同法制备阴性样品液。 2.1.5 测量波长的确定 分别精密取蒸馏水、牛血清白蛋白标准液、样品液、阴性样品液各1.00 ml,依次加入5.00 ml考马斯亮蓝试剂,在200～700 nm范围内进行全波长扫描。结果表明,牛血清白蛋白标准液、样品液在波长为595 nm都有最大吸收,阴性样品液干扰较小,选择595 nm为测量波长。 2.1.6 线性关系的考察 分别制备不同浓度的牛血清白蛋白标准液,加入考马斯亮蓝试剂,在595 nm测吸光度,以A 595 nm为纵坐标,标准蛋白含量为横坐标,绘制标准曲线,回归方程为Y=0.010 97X-0.070 89,r=0.999 8,线性范围为20～100 μg/ml。 2.2 正交实验 2.2.1正交试验因素水平 参考文献[4-5],根据单因素实验结果,选择胃蛋白酶、9倍水,确定正交实验因素水平,以L9(34)进行实验。2.2.2 正交试验方法与结果 方法:取水牛角粉1.00 g,加入胃蛋白酶,蒸馏水9.00 ml,盐酸调pH值,水浴提取。提取液85℃灭活15 min,滤过,稀释滤液,12 000 r/min离心,上清液作为样品液。取样品液,加入考马斯亮蓝试剂,595 nm测吸光度,经分析,酶解最佳条件为A2B2C2D2,即:加酶量700 U/g、温度39℃、pH=2、时间4 h。。 2.3工艺验证实验 用A2B2C2D2条件进行3次工艺验证,RSD=1.61%,结果表明酶解提取工艺良好。 3 讨论 实验结果表明,水牛角最佳酶解提取工艺为:胃蛋白酶、9倍水、700 U/g、39℃、pH=2、时间4 h。酶的特点是催化效率高,专一性强,作用条件温和。蛋白酶能使蛋白质水解成肽和氨基酸,提高和改善蛋白质的溶解性、乳化性、起泡性、黏度等。生物酶仿生提取能避免酸法水解和碱法水解对蛋白类物质的破坏和变旋作用,有利于防止活性成分失活损失,确保临床疗效。中药材直接口服,一般生物利用度低,浪费原料。本研究模拟人体胃肠道环境,采用生物酶仿生提取水牛角活性物质,利于防止活性成分失活损失,建立了一种用于水牛角酶解物的检测方法,为进一步研究奠定了基础