氯化三苯四氮唑对金黄色葡萄球菌抑制性实验观察.docVIP

氯化三苯四氮唑对金黄色葡萄球菌抑制性实验观察在细菌检验工作中,菌落总数测定是用于检验样品被污染程度的一项基本指标。我国的食品检验国家标准采用普通琼脂倾注法［1］，但是,在实际工作中,往往会因为被检验样品中含有沉渣(食品中的碎屑、化妆品中的颗粒等)，其形态类似细菌,给菌落计数工作造成一定的困难。我国的化妆品国家标准《化妆品卫生规范》2007版中介绍：在每100mL卵磷脂吐温８0营养琼脂培养基中可加入0.5%氯化三苯四氮唑(TTC)溶液1mL用于菌落总数的测定的实验方法［2］，其原理是检样中如有细菌存在,培养后细菌在脱氢酶的作用下, TTC接受氢而变成红色,使细菌着色,而检验样品中如存在碎屑或颗粒无颜色变化,便于菌落计数。但是,也有一些文献报道,如用上述浓度的TTC营养琼脂对金黄色葡萄球菌生长有抑制作用［3］。为了解含不同浓度TTC营养琼脂对金黄色葡萄球菌的抑制性,我们用含不同浓度TTC营养琼脂和营养琼脂2种方法对我们实验室保存的金黄色葡萄球菌菌落计数的结果作了比较,现将结果报道如下。?? 1材料与方法? 1.1培养基和试剂的来源和制备? 营养琼脂由上海华康科技公司生产，批按培养基瓶贴所示配制方法制备，高压灭菌后备用, TTC由上海试剂三厂生产，批用蒸馏水分别配成(g/mL)0.5%、 0.25%、 0.125%、0.062%4个不同浓度,高压灭菌后备用。 1.2实验菌株及来源? 实验室保存金黄色葡萄球菌3株(ATCC25923;ATCC6538;CMCC(B)26003),收集从临床标本中分离后经鉴定确认金黄色葡萄球菌7株(鉴定试验包括革兰染色为阳性球菌、血平皿上菌落为金黄色有溶血环、Baird-parker平皿上菌落形态符合金黄色葡萄球菌特征、7.5%氯化钠葡萄糖肉汤生长、血浆凝固酶试验阳性，分别编号为0601―0607)。? 1.3实验步骤? 1.3.1平皿计数法(国标法) 按《GB/T4789.2―2003菌落总数测定》方法进行。? 1.3.2TTC平皿计数法待营养琼脂冷至50℃左右，无菌操作分别加入上述经灭菌处理的各不同浓度TTC溶液1mL，使最终每100mL营养琼脂的含TTC浓度分别为5mg、2.5mg、1.25mg、0.62mg。? 1.3.3菌液的制备分别取金黄色葡萄球菌实验菌株纯培养物接种营养肉汤培养基,经37 ℃ 24 h培养,取培养液加入生理盐水稀释,使菌液最终浓度控制在约30~300 CFU/mL。? 1.3.4无菌操作分别用无菌吸管取经稀释的菌液1mL注入无菌平皿,用营养琼脂和含各不同浓度TTC营养琼脂分别倾注(每个稀释度做5个平皿,计数时取其平均值), 经37 ℃ 24 h培养后,取菌落数在30~300 CFU/mL之间的平皿进行计数。?? 2结果? 实验结果显示，在10株供实验的金黄色葡萄球菌中，除1株菌号为0602金黄色葡萄球菌表现对TTC不敏感，其余9株金黄色葡萄球菌在TTC浓度分别为5mg和2.5mg/100mL营养琼脂中生长完全被抑制。当TTC浓度在1.25mg/100mL营养琼脂时仍有3株菌不生长，只有当TTC浓度降到0.62mg/100mL营养琼脂的时候，和对照营养琼脂比较，菌落计数结果两组相符合（表1、表2）。?? 3讨论? TTC对金黄色葡萄球菌具有抑制作用，表现为TTC浓度越高,抑制作用越明显。但是在本次实验中也发现，仅有1株金黄色葡萄球菌对TTC表现为不敏感。TTC为何对革兰阳性金黄色葡萄球菌有抑制作用，有文献报道，可能与革兰阳性的金黄色葡萄球菌细胞壁上的肽聚糖和磷壁酸含量高有关［3］，也有文献报道称TTC对革兰阴性杆菌无抑制作用［4,5］。? 实验结果显示,用4个含有不同浓度TTC营养琼脂与营养琼脂做对照试验用于金黄色葡萄球菌计数, 仅有用最低浓度(每100mL营养琼脂含0.62mgTTC)组的计数结果与营养琼脂计数结果对比,差异无统计学意义。但是在实验中发现,如用此浓度的TTC营养琼脂对金黄色葡萄球菌计数，菌落不显红色, TTC已不能起指示作用,因此也失去了其使用价值。? 根据菌落总数的定义,是指检验样品经过处理，在一定条件下培养后，所得１mL检样中所含菌落的总数，在被检样品中既可能有革兰阴性杆菌，也可能有革兰阳性金黄色葡萄球菌，按照在每100mL营养琼脂培养基中可加入5mg/100mL TTC溶液1mL用于菌落总数的测定的实验方法, 如果检验样品中确实存在金黄色葡萄球菌，就有可能将细菌总数超标的不合格品判为合格产品，影响了菌落计数的真实性和判断实验的准确性。通过实验证实TTC对革兰阳性的金黄色葡萄球菌的生长繁殖具有抑制作用，此