褪黑素对烫伤大鼠脑组织抗氧化能力及星形胶质细胞影响.docVIP

褪黑素对烫伤大鼠脑组织抗氧化能力及星形胶质细胞影响【摘要】 目的 观察褪黑素(melatonin,MT)对烫伤大鼠脑组织GSH、SOD与MDA含量与星形胶质细胞的影响，以探讨烫伤后MT的神经保护机制。方法 随机将30只SD大鼠，分为正常对照组、烫伤组和MT治疗组；MT治疗组在烫伤后10 min, 3 h分别给予MT (10 mg/kg)腹腔注射治疗，对照组与烫伤组给予等量体积的生理盐水。MT治疗结束后1 h取脑行GSH、SOD与MDA含量检测，然后取额叶皮质行GFAP免疫组化染色，光镜下观察星形胶质细胞的形态变化并进行计量分析。结果 与正常对照组相比，烫伤组大鼠脑组织GSH含量下降，而SOD与MDA含量增加, GFAP阳性神经元增多(P 1.3 实验方法? 1.3.1 烫伤模型构建 单笼喂养1周后制成烫伤模型，烫伤前禁食12 h。参照叶建勋等方法［4］略做改良进行，将烫伤仪温度设置在105℃，待压力锅内压力达到70kPa时，多次启动通气开关，使整个通气管道温度加热到所设定值，管出口处凝结水减少；设定通气时间为10 s。所有动物烫伤前1 d用10％硫化钠(Na??2?S)脱去背部的毛，制作烫伤模型前腹腔注射1％戊巴比妥钠(30 mg/kg)麻醉，将烫伤仪喷射盘置于大鼠背部固定，启动控制器开关，9s后喷射口蒸气停止，完成致伤过程。烫伤面积约30％，烫伤程度Ⅲ伤(病理切片证实)。伤后迅速脱离热源,保温。MT治疗组伤后10 min, 3 h分别两次给予MT(10 mg/kg)溶液腹腔注射治疗, 正常对照组与烫伤组给予等量体积的生理盐水。? 1.3.2 脑组织匀浆的制备 每组5只大鼠于MT治疗结束后1 h采用脱颈椎法处死取脑，置冷生理盐水中冲净血液后取出，用滤纸吸干水分，低温环境下迅速称重，用移液管量取冷生理盐水，生理盐水的体积总量是组织块重量的9倍，在生理盐水中剪碎组织块。倒人匀浆管中进行匀浆，充分研碎，倒入试管中，即制备好了10％的组织匀浆。将其置于冷冻离心机中，以3500 r/min离心10 min，提取上清液用于抗氧化酶活力与MDA的检测。? 1.3.3 GSH、SOD、MDA的检测 取脑组织匀浆上清液1.0 ml，严格按照试剂盒的说明分别采用比色法、黄嘌呤氧化酶法测定和硫代巴比妥酸法测定GSH、SOD、MDA吸光度值，最后分别计算出样本中的GSH、SOD、MDA含量。? 1.3.4 GFAP免疫组织化学染色 剩余大鼠麻醉后取脑、石蜡包埋，冠状切片、贴片。石蜡切片常规脱蜡至水；用3%的H??2?O??2?灭活内源性酶，用蒸馏水洗涤；微波修复抗原1次，冷却后用0.02 mol/L的PBS溶液冲洗；滴加5%正常山羊血清封闭液，室温下反应20 min，甩去多余的液体，不洗；滴加浓度为1?∶?200的兔抗GFAP，湿盒中孵育，过夜，PBS冲洗3次，2 min/次；滴加生物素化山羊抗兔IgG，湿盒中37 ℃孵育20 min，PBS冲洗3次，2 min/次；滴加SABC，湿盒中孵育20 min，PBS冲洗；DAB显色，光镜下控制显色深度，蒸馏水洗涤3次，2 min/次；脱水、透明、封片。以胞质中出现棕黄色颗粒为阳性细胞。对照组切片用PBS冲洗液取代一抗，其余步骤同实验组。? 1.4 图像处理 用Mias图像分析软件，对每个鼠脑取相同间隔的3张切片，对每张切片黑质致密部各测5个视野,在同一放大倍数(物镜40)、同一视场面积、同一背景光强度下，分别对额叶皮质GFAP免疫组化阳性神经元进行计数，测量GFAP阳性反应产物的平均光密度值。? 1.5 统计学方法 测定结果用SPSS12.0(SPSS公司)统计软件进行统计处理,分析结果用(x±s)表示，多组比较采用单因素方差分析。P 1