腺病毒的包装,纯化和感染.PDFVIP

腺病毒的包装，纯化和感染 技术背景：Adeasy 系统利用了腺病毒具有的高感染能力，可高度浓缩等优点， 并破坏了腺病毒基因组中的早期基因E1 ，使之成为较为安全、高效的病毒载体。 利用带有E1 基因的293 细胞作为包装细胞，通过倍比扩增，富集病毒颗粒，并 通过CsCl 梯度离心，透析进行分离纯化。对绝大多数的细胞株可以达到近乎100 ％的感染效率。但需要指出的是Adeasy 同样具有所有病毒载体或转染试剂都不 可避免的细胞毒性问题。 所需试剂：  293 细胞；  重组好的腺病毒质粒；  Pac I 限制性内切酶；  质粒回收相关试剂；  细胞培养、转染相关试剂；  TBS ：10mM Tris, 0.9% NaCl, pH8.1;  40% CsCl ：28.45 g CsCl 溶于42.7 ml 的TBS 中，4 度保存；  15% CsCl：9.085 g CsCl 溶于47.69 ml 的TBS 中，4 度保存；  Beckman 离心管：14*89 mm ，SW41 转头；  Polybrene (sigma)，10 mg/ml ；  透析袋：Spectrum Co. （成卷供应，带少量甘油，硫化物与重金属）， MW=8000~ 14400；  灭菌甘油。 操作流程： 1. 293 细胞（E1-transformed human embryonic kidney cells 在转染前24 小时接种 于1 或2 个60 mm 培养盘中，使之在转染时细胞汇合率为50-70% ； 2. 在转染前，用Pac I 处理目的质粒 （一般一个60 mm 细胞盘需要6µg DNA ）。 处理后质粒用乙醇沉淀并重悬于20 µl 无菌水中； 3. 用PEI 或其他转染试剂将6 µg Pac I 处理过的质粒转染细胞； 1 4. 8 个小时后移去混合液，加入 4 ml DMEM 完全培养液 （10% CBS ，1% Pen/Strep ）； 5. 在转染后7 到10 天用细胞刮 （而不是胰酶）将细胞从瓶中刮下并移入50ml 锥形管。离心后将细胞重悬于2.0 ml PBS 或全培液中。于液氮中冻结细胞， 37℃水浴中溶解，剧烈振荡。此步骤共进行4 次。注意保存时不要反复冻融， 可保存于-20 ℃； 6. 将293 细胞以50-70% 的汇合率铺于60 mm 培养盘中，以30-50%的体积比加 入含病毒上清液。在感染后2-3 天即可看到明显的细胞裂解或CPE 现象； 7. 在有 1/3 到 1/2 的细胞脱离漂浮时，通常是感染后 3-5 天收集病毒。可进一 步通过Western blot 或PCR （5 µl 病毒上清加上10 µl PCR-grade Protease K， 55℃消化1 小时，然后煮沸样品5 min，离心后取1-2 µl 进行PCR 反应）证 实重组腺病毒的存在； 7 8. 按步骤5 的方法收集病毒上清。在这种情况下一般至少可收集到10 infectious particles/ml 的病毒。每轮的扩增应能提高一个数量级的梯度； 9. 为了进一步扩增，将步骤8 获得的病毒上清进一步感染100 mm 培养盘的细 胞，按步骤5 的方法收集病毒，并进而将其感染150 mm 细胞培养盘中的293 细胞，以获得足够量的病毒； 10. 将 15% CsCl 和40% CsCl 加入Beckman 离心管中制备CsCl 梯度溶液； 11. 将最终富集病毒颗粒的病毒上清滴加于CsCl 梯度溶液上； 12. 超速离心，30000 rpm ，4 度离心16 个小时； 13. 离心后，应有两条带。位置较高，颜色较弱的条带主要为腺病毒空壳，不具 感染能力；位置较低，颜色较亮的条带含有我们需要收集的活病毒颗粒。用 16 号针头将这一条带收集； 14. 在TBS 中透析一小时，随后在含有10％甘油的TBS 中透析两次，每次一小 时； 15. 将纯化的